Name: Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri un metodo RT-PCR strand-specifico per rilevare trascritti antisense di HIV-1 ASP nei pazienti. Questa tecnica utilizza primer biotinilati e alte temperature di denaturazione per amplificare cDNA antisense con elevata specificità.

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Ringraziamo Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick e Matthieu Perreau per essere sempre disponibili a discutere del nostro lavoro e di tutte le persone del Laboratorio di AIDS Immunopatogenesi per la loro preziosa assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare John e Aaron Weddle di VSB Associated Inc. Infine, tanti ringraziamenti speciali a tutti i Pazienti, senza i quali questo lavoro non sarebbe stato possibile. Questo lavoro non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica da qualsiasi agenzia di finanziamento.

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infezione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) con ceppo HIV-1HXB2
<ol><li>
Giorno 1: PBMC STIMULATION
	<ol>
<li>Isola i PBMC da un cappotto sano per i donatori.</li>
		<li>Contare e risospendere i PBMC a una concentrazione di 1x106/mL nel roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio completo contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicilli in/streptomicina (R-10), con aggiunta di 50 U/mL di interleuche-2 (IL-2) e 3 fitoaemagglutina g/mL (PHA).</li>
		<li>Pipet su e giù e dividere le cellule in due piastre a sei pozzetti (3 mL di sospensione cellulare / bene).</li>
		<li>Incubare per 3 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Giorno 3: PMC INFECTION NOTA: Utilizzare una delle due piastre come nel passaggio 1.1.3 come controllo negativo (non infettare queste cellule). AVVISO: Eseguire l'intera procedura in un laboratorio di biosicurezza di livello III (P3).<ol>
<li>Piscina PBMCc da una piastra in un tubo falco 50 mL e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 2,2 mL di R-10 contenenti 20 U/mL di IL-2 e 2 g/mL di polibrene.</li>
		<li>Scongelare le fiale contenenti il virus HIV-1HXB2 e aggiungere 1,8 mL di sospensione virale (0,376 ng/L) alle cellule.</li>
		<li>Incubare le cellule per 2 h a 37 gradi centigradi, ruotando delicatamente il tubo ogni 30 min.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule a 1x106/mL in R-10 contenente IL-2 (50 U/mL).</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare su una piastra di 24 pozze ad una concentrazione di 1 mL/pozzo e incubare per 5 giorni a 37 e 5% CO2.</li>
		<li>Raccogliere 1 bene ogni giorno e trasferire le cellule a tubo da 1,5 mL (etichettato con il giorno dell'infezione). NOTA: prima della centrifuga, trasferire 150 l di sospensione cellulare in un tubo di citometria a flusso per il controllo della qualità dell'infezione da PBMCC (vedere il punto 1.3)</li>
		<li>Centrifugare i tubi a 400 x g per 10 min e scartare il supernatante.</li>
		<li>Congelare i pellet delle cellule a -80 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infezione PBMCs: controllo di qualità
	<ol>
<li>Per ogni giorno di infezione, raccogliere 150 l di PBC infetti e trasferirli in un tubo di citometria a flusso.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) e centrifugare a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante e aggiungere 50 L di PBS contenente 1 OL L di Aqua live/dead dye (precedentemente diluito 1:10 con PBS).</li>
		<li>Incubare a 4 gradi centigradi per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 400 x g per 5 min, e scartare supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 250 -L di soluzione di fissaggio/permeabilizzazione e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 1x Perm/Wash Buffer (10x soluzione di stock contenente sia FBS che saponindi diluito 1:10) e centrifugare a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e aggiungere 50 - L di PBS contenente HIV Gag p24 fluoresceinisonina (FITC) -emigito anticorpo (diluito 1:10).</li>
		<li>Incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 400 x g per 5 min, e scartare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 150 l di x CellFIX (soluzione di stock 10x contenente 10% formaldeide, 3,55% di metanolo, 0,93% acita di sodio diluito 1:10) e analizzare le cellule per citometria di flusso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Stimolazione delle cellule T umane CD4 con anticorpi anti-CD3/CD28
<ol><li>Isolare le cellule T CD4 dai PBMC di pazienti affetti da HIV-1 e donatori sani.</li>
	<li>Preparare il mix di anticorpi anti-CD3/CD28 umani diluindo anti-CD3 (1:100) e anti-CD28 (1:50) in PBS.</li>
	<li>Coprire una piastra di 48 pozzetti aggiungendo 200 l'una di miscela di anticorpi per bene ad un numero adeguato di pozzi e incubare a 37 gradi centigradi per 2 h.</li>
	<li>Aspirati la soluzione anticorpale e aggiungete 1 mL di cellule CD4-T a 1x106/mL ai pozzetti anticorpi anti-CD3/CD28. NOTA: Stimolare le cellule T CD4 fino a 5 giorni.</li>
</ol>3. Trascrizione inversa
NOTA: Per ottenere primer specifici del paziente, il DNA provirale isolato dalle cellule CD4-T di ogni paziente è stato amplificato utilizzando primerHIV-1 HXB2 Pan ASP. I primer specifici del paziente sono stati progettati utilizzando la sequenza provirale interna ai primer Pan ASP. Tutti i primer e le sonde utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 2.
<ol><li>
Isolamento dell'RNA totale dalle cellule
	<ol>
<li>Quantifica l'RNA ed elimina la contaminazione del DNA trattando i campioni con DNase.</li>
		<li>Eseguire reazioni DI RT in un volume di 50 .L. Trasferire 0,1-1 g di RNA totale in un numero appropriato di pozze di una piastra PCR 96-well. Preparare la miscela di RNA aggiungendo i seguenti componenti all'RNA: 5 - L di primer inverso ASP biotinylato (20 M) 2,5 l l di trefosdi deoxynucleotide (dNTP) (10 mM) 25 -L di acqua distillata trattata con dietilpirocarburo (DEPC) (dH2O). Preparare i controlli Endogeni RT aggiungendo 5 - L di acqua priva di nuclesiera al posto dell'innavorino inverso ASP biotinyato.</li>
		<li>Mettere la piastra PCR 96 po ' bene in un termociclore e riscaldare la miscela di RNA a 94 gradi centigradi per 5 min.</li>
		<li>Raffreddare immediatamente la miscela di RNA in acqua ghiacciata per almeno 1 min.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione aggiungendo i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL (calcolare il numero totale di campioni più 1): 10 L di buffer 5x RT 2,5 L di 0,1 M di 1,4-dithiothreitol (DTT) 2,5 ll di RNase fuori (40 unità / l) 2,5 l di enzima RT (200 unità/L)</li>
		<li>Trasferire 17,5 l di questa miscela in ciascuno dei pozzi contenenti RNA. Preparare i controlli RT-minus sostituendo la trascrizione inversa con 2,5 gradi di acqua priva di nuclea.</li>
		<li>Mescolare delicatamente e incubare la piastra a 55 gradi centigradi per 60 min utilizzando un termociclore.</li>
		<li>Inattivare le reazioni riscaldando a 70 gradi centigradi per 15 minuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Purificazione dell'affinità del cDNA biotinylato ASP
NOTA: non purificare le reazioni RT-meno.
<ol><li>Preparare 1 L di 2x buffer di lavaggio/associazione contenente 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM di acido etilenediaminetraetraacetica (EDTA) e 2 M NaCl. Filtrare la soluzione.<ol>
<li>Preparare 50 mL di 1x lavaggio/binding buffer utilizzando acqua di grado PCR.</li>
		<li>Per ogni reazione, utilizzare 10 L di perline magnetiche coniugate con streptavidin. In base al numero di reazioni, trasferire un volume appropriato di perline in un tubo da 1,5 mL.</li>
		<li>Lavare le perline aggiungendo un volume uguale di 2x lavaggio / rilegatura buffer e vortice per 15 s.</li>
		<li>Mettere il tubo in un rack di separazione magnetica e incubare per 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare le perline e aggiungere lo stesso volume di lavaggio / rilegatura buffer 2x come volume iniziale di perline.</li>
		<li>Vortice per 30 s e trasferire 10 gradi l delle sospensioni perline ad un numero appropriato di tubi da 1,5 mL.</li>
		<li>Mettere i tubi in un rack di separazione magnetica e incubare per 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminare il supernatante e aggiungere 50 l di lavaggio/rilegatura buffer 2x.</li>
		<li>Aggiungere 50 -L di cDNA biotinylato ai tubi corrispondenti contenenti le perline.</li>
		<li>Incubare per 30 min a temperatura ambiente ruotando delicatamente.</li>
		<li>Separare le perline dal supernatante da un rack di separazione magnete per 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare le perline aggiungendo 200 l un l di 1x lavaggio/ buffer di rilegatura. Mettere i tubi in un rack di separazione magnete per 3 min a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Ripetere due volte.</li>
		<li>Risospendere le perline in 10 gradi l di acqua di grado PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PCR standard
NOTA: lo scopo della PCR standard è quello di amplificare l'intera ORF del gene ASP. I prodotti di amplificazione vengono poi clonati in pCR2.1 plasmide per sviluppare curve standard per la quantificazione dell'RNA ASP tramite PCR in tempo reale (vedi PCR in tempo reale del paragrafo).
<ol><li>Eseguire i PCR standard in un volume totale di 50 .L. Preparare un volume appropriato di mix master PCR (numero di campioni più 1). Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL: 1 - L di 10 M - Primer ASP (avanti e indietro) 1 - L di 10 mm dNTP Cloruro di magnesio (MgCl2)(la concentrazione dipende dai primer utilizzati) dH2O ad un volume finale di 49<ol>
<li>Mescolare bene, girare rapidamente verso il basso il contenuto e trasferire 49 l/poggia del mix master PCR a una piastra PCR 96-well.</li>
		<li>Vorticare con attenzione i tubi contenenti le perline utilizzate per la purificazione dell'affinità ASP cDNA per 15 s.</li>
		<li>Aggiungete 1 l di perline nei pozze corrispondenti ed eseguite la PCR utilizzando il seguente programma: 95 gradi centigradi per 2 min, 40 cicli di 95 gradi centigradi per 30 s, 55 gradi centigradi per 30 s e 68 gradi per 40 s, quindi 68 gradi centigradi per 7 min.</li>
		<li>Separare i prodotti PCR su gel di agarose dell'1%, tagliare le bande e clonare i prodotti amplificati in pCR2.1 plasmide.</li>
		<li>Sequenziare e analizzare le sequenze di ogni clone.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PCR quantitativo in tempo reale (qPCR)
NOTA: sviluppare primer e sonde specifiche per il paziente utilizzando l'approccio descritto nel passaggio 3 "Trascrizione inversa". Per qPCR includere diluizioni plasmide ASP per curve standard. Plasmidi contenenti inserti specifici per il paziente sono sviluppati come menzionato nella nota all'inizio del passaggio 5 "PCR standard".
<ol><li>Preparare la curva standard utilizzando diluizioni seriali plasmidASP 1:10 a partire da 3 x 106 copie/L fino a 3 copie/L.<ol>
<li>
PCR al primo round (preamplificatore). Eseguire reazioni in un volume totale di 25 . Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL: 0,5 l di ASP o env primer mix (concentrazione finale 0,2 m ciascuno) (avanti e indietro) 0,5 l di miscela di dNTP (concentrazione finale 0,2 mM ciascuno) MgCl2 (la concentrazione dipende dalle coppie di primer) dH2O ad un volume finale di 24</li>
		<li>Trasferire 24 l di miscela master PCR su un numero appropriato di pozze di una piastra PCR da 96 pozze.</li>
		<li>Vorticare con cura i tubi contenenti le perline con il cDNA per 15 s.</li>
		<li>Aggiungere 1 ll di perline ai pozze corrispondenti. Fate lo stesso per le diluizioni plasmide.</li>
		<li>Eseguire la PCR utilizzando il seguente algoritmo: denaturazione per 2 min a 95 gradi centigradi; 30 s a 95 gradi centigradi, 30 s a 55 s, 40 s a 68 gradi centigradi per 18 cicli; estensione a 68 gradi centigradi per 7 min.</li>
		<li>Diluire i PCR del primo round reazioni 1:5 con acqua di grado PCR.</li>
		<li>
Secondo round qPCR. Eseguire reazioni in un volume totale di 20 .L. Preparare un volume appropriato di miscela master PCR (numero di campioni più 1). Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL: 1,8 -l 10 M primer (avanti e indietro) 1 l- di 5 sonda M 6,2 ll di dH2O</li>
		<li>Trasferire 19 l di qPCR master mix in un numero appropriato di pozze di una piastra qPCR 96-po'e aggiungere 1 -L delle reazioni PCR del primo round diluito ai pozzi corrispondenti. Fate lo stesso per le diluizioni del plasmide.</li>
		<li>Eseguire il qPCR con il seguente algoritmo: denaturazione per 10 min a 95 gradi centigradi; 15 s a 95 , 1 min a 60 gradi centigradi per 40 cicli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li>
<li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv%2B+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li>
<li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li>
<li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74(2011).</li>
<li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71(2007).</li>
<li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38(2012).</li>
<li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li>
<li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li>
<li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).</li>
<li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li>
<li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).</li>
<li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antisense+protein+%28ASP%29+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li>
<li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells%3A+improvement+by+tagged+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221(2009).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li>
<li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li>
<li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+%28HTLVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

In questo rapporto viene descritto un saggio RT specifico del filamento applicato al rilevamento dell'RNA ASP nelle cellule T CD4, isolate da individui infettati dall'HIV-1. Il verificarsi di priming non specifico durante RT ostacola la rilevazione di trascrizioni dell'RNA con la polarità destra, portando a un'errata interpretazione dei risultati. I gruppi precedenti hanno sviluppato diverse strategie volte a prevenire la sintesi cDNA indipendente dal primer durante la reazione RT. Contrassegnare l'inversione all'estremi...

Il gene della proteina antisenso (ASP) è un telaio di lettura aperto (ORF) situato sul filamento negativo del gene dell'involucro (HIV-1) del virus dell'immunodeficienza umana, che si estende sulla giunzione gp120/gp411. Negli ultimi 30 anni, diversi rapporti hanno dimostrato che il gene ASP HIV è effettivamente trascritto e tradotto2,3,4,5,6,7,8,9. Anche se le trascrizioni antisense ASP sono state completamente caratterizzate in vitro, fino a poco tempo fa mancavano ancora informazioni sulla produzione effettiva di RNA ASP nei pazienti.
La sequenza di ASP è inversa e complementare all'ambiente di env. Questo rappresenta un ostacolo importante quando si tenta di rilevare le trascrizioni per ASP. I metodi standard di reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzano primer antisense specifici genici per sintetizzare DNA complementari (CDA) della polarità destra. Questo approccio, tuttavia, non consente di determinare l'orientamento (senso o antisenso) del modello di RNA iniziale, poiché le forcine o i loop di RNA possono innescare RT in entrambe le direzioni in assenza di primer10, un fenomeno noto come RT self-priming. La maggior parte degli investigatori ASP elude il problema dell'auto-priming RT utilizzando i primer contrassegnati con sequenze che non sono correlate all'HIV-111,12. Questa strategia, tuttavia, non elimina il verificarsi del fenomeno e può portare a potenziali riporti di cDNA non specifici nel PCR11.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo saggio RT-PCR specifico del filamento per lo studio dell'RNA antisenso e l'abbiamo utilizzato per il rilevamento dell'RNA ASP in una coorte di sei pazienti affetti da HIV, come mostrato nella tabella 1. La procedura descritta di seguito è stata precedentemente pubblicata da Antonio Mancarella etal. Nel nostro protocollo, evitiamo la produzione di cDNA non specifici con un duplice approccio. In primo luogo, eliminiamo le strutture secondarie dell'RNA denimentando l'RNA ad alta temperatura (94 gradi centigradi), e in secondo luogo, invertiamo l'RNA ASP utilizzando un primer biotinylato specifico di ASP e purificando l'affinità-purificailo il cDNA risultante. Con questo approccio, siamo in grado di amplificare solo il nostro cDNA target, poiché altri prodotti RT non specifici sono o impedito di essere generati (denaturazione ad alta temperatura di RNA) o eliminati prima della PCR (purificazione dell'affinità).

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 Kit di sequenziamento del ciclo</td><td>Biosistema applicato, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set (100 mM)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidina</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Cellula T CD4+ umana Kit di isolamento</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Biowest</td><td></td><td>S1010-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag p24 citometria a flusso - Kc57-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604665</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>Lectina da Phaseolus vulgaris (PHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte gialle fissabile, per eccitazione a 405 nm</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Umano CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>Primer e Sonde</td><td>DNA Integrato Tecnologie (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Platino Taq DNA Polimerasi Alta Fedeltà</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene Infezione / Reagente di Trasfezione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>Kit</tr><tr><td>di clonazione 4369016 TOPO TA per il subclonaggio, con cellule di E. coli chimicamente competenti One Shot TOP10</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNasi (2 U/&micro; L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclatore</td><td>Applicato Biosistema, Thermo Fisher Scientific 4375786</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di trascrizioni di rna di tipo 1 (hiv-1) di proteina antisenso (asp) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di rt-pcr specifico di strand

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Nei retrovirus, la trascrizione antisenso è stata descritta sia nel virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) che nel virus T-linfotropico umano 1 (HTLV-1). Nell'HIV-1, il gene ASP della proteina antisenso si trova sul filamento negativo di env, nel fotogramma di lettura -2, che si estende per la giunzione gp120/gp41. Nell'orientamento del senso, l'estremità 3' del frame di lettura ASP aperto si sovrappone alle regioni ipervariabili gp120 V4 e V5. Lo studio dell'RNA ASP è stato ostacolato da un fenomeno noto come RT-self-priming, per cui le strutture secondarie dell'RNA hanno la capacità di innescare RT in assenza del primer specifico, generando cDNA non specifici. L'uso combinato dell'elevata denaturazione dell'RNA con primer inversi biotinylati nella reazione RT, insieme alla purificazione dell'affinità del cDNA su perline magnetiche rivestite di streptavidin, ci ha permesso di amplificare selettivamente l'RNA ASP nelle cellule T CD4, derivate da individui infettati da HIV-1. Il nostro metodo è relativamente a basso costo, semplice da eseguire, altamente affidabile e facilmente riproducibile. A questo proposito, rappresenta un potente strumento per lo studio della trascrizione antisenso non solo in HIV-1 ma anche in altri sistemi biologici.

La denaturazione dell'RNA ad alta temperatura accoppiata alla purificazione dell'affinità del cDNA biotinylato previene l'amplificazione di prodotti ASP non specifici durante la PCR nei PBMC infettati in vitro e nelle cellule T CD4 isolate dai pazienti. È stato dimostrato che l'auto-priming RT si verifica durante la trascrizione inversa degli RNA antisenso10,14,15,16,<sup cl...

Le forcine e i loop di RNA possono funzionare come primer per la trascrizione inversa (RT) in assenza di primer specifici della sequenza, interferendo con lo studio delle trascrizioni antisense sovrapposte. Abbiamo sviluppato una tecnica in grado di identificare l'RNA specifico del filamento, e l'abbiamo usata per studiare la proteina antisenso HIV-1 ASP.

Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Gli RT-PCR convenzionali non consentono discriminazioni tra le sequenze di senso e anti-senso quando vengono utilizzati per rilevare gli RNA codificati da geni sovrapposti. Questo protocollo consente di rilevare RNA specificamente anti-senso. L'uso di primer biotinolati insieme ad alte temperature di denaturazione dell'RNA consente l'amplificazione di cDNA anti-senso, impedendo la formazione di prodotti RT non specifici.Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che l'ASP sia come anti-senso dell'RNA che come precursore proteico, è un nuovo antigene hiv, lo fa potenzialmente un nuovo bersaglio hiv per la terapia. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema, in cui possono essere rilevati RNA anti-senso da geni sovrapposti. Inizia progettando primer specifici per pazienti utilizzando la sequenza di DNA pro-virale interna ai primer PanASP.Successivamente, quantificare l'RNA ed eliminare la contaminazione da DNA trattando campioni con DNasi. Trasferire tra 0,1 e un microgrammo di RNA totale nei pozzi appropriati su una piastra PCR da 96 porri. Quindi impostare la trascrizione inversa, o reazione RT, secondo le indicazioni del manoscritto.Preparare i controlli RT endogeni aggiungendo cinque microlitri di acqua libera da nucleasi anziché il primer inverso ASP. Mettere la piastra nel termociclo e riscaldare l'RNA a 94 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raffreddarlo immediatamente in acqua ghiacciata per almeno un minuto.Preparare la miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri come descritto nel manoscritto testuale, quindi trasferire 17,5 microlitri in ciascuno degli RNA contenenti pozzi. La denaturazione dell'RNA deve essere eseguita a 94 gradi centigradi. Senza denaturazione totale, possono verificarsi sintesi di prodotti non specifici dall'RNA di senso, portando all'amplificazione di cDNA non specifici.Mescolare delicatamente il contenuto dei pozzi e incubare la piastra a 55 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi, inattivare le reazioni riscaldando la piastra a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Preparare un litro di tampone di lavaggio e rilegatura 2X in base alle indicazioni manoscritte e filtrare la soluzione.Successivamente, preparare 50 millilitri di tampone di lavaggio e rilegatura 1X utilizzando acqua di grado PCR. Trasferire il numero appropriato di perline magnetiche coniugate con streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri, quindi lavarle aggiungendo un volume uguale di tampone di lavaggio e legame 2X e vortice del tubo per 15 secondi. Posizionare il tubo in un rack di separazione magnetico e incubarlo per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere con cura il supernatante senza disturbare le perline e aggiungere lo stesso volume del tampone di lavaggio e rilegatura 2X del volume iniziale delle perline. Vortice le perline per 30 secondi e trasferire 10 microlitri della sospensione ad un numero appropriato di tubi da 1,5 millilitri. Posizionare i tubi nel rack di separazione magnetica e incubarli per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi, scartare il supernatante e aggiungere 50 microlitri di lavaggio 2X e tampone di legame. Aggiungere 50 microlitri di cDNA biotinilato ai tubi corrispondenti con le perline e incubarli per 30 minuti ruotando delicatamente. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica per tre minuti, quindi lavare le perline con 200 microlitri di lavaggio 1X e tampone di legame, seguito da un'incubazione di tre minuti sul rack di separazione.Scartare il supernatante e ripetere il lavaggio due volte. Quindi, rimospendare le perline in 10 microlitri di acqua di grado PCR. Preparare un volume appropriato di PCR Master Mix in base alle indicazioni manoscritte.Mescolarlo bene e farlo girare rapidamente verso il basso, quindi trasferire 49 microlitri per pozzo su una piastra PCR da 96 po '. Vortice attento i tubi con il cDNA purificato per 15 secondi e aggiungere un microlitro della sospensione ai pozzi corrispondenti. Eseguire la PCR e separare i prodotti su un gel di agarosio dell'1%.Tagliare le bande dal gel e clonare i prodotti amplificati in un plasmide PCR 2.1. Quindi sequenziare i cloni e analizzare ogni sequenza. Le prime reazioni RT sono state eseguite con il regolare primer anti-senso non biotinylato e hanno portato ad un'amplificazione riuscita dell'ASP.Tuttavia, fu amplificata anche una banda dello stesso peso molecolare e controlli più minuscoli. Per aggirare questo problema, il primer anti-senso specifico è stato etichettato con biotin e il cDNA anti-senso risultante è stato purificato prima della PCR. Ciò ha permesso di amplificare la sequenza ASP con una contaminazione notevolmente ridotta dal cDNA non specifico nei controlli primer minus.Un'ulteriore ottimizzazione di questo metodo è stata ottenuta con la completa denaturazione dell'RNA a 94 gradi Celsius prima di RT, seguita dal raffreddamento immediato sull'acqua ghiacciata, che ha portato a un'amplificazione efficace della banda ASP e nessun prodotto non specifico. La cinetica dell'RNA ASP è stata misurata e le cellule CD4 isolate da tre soggetti sieropositiva con viremia rilevabile e assenza di terapia a seguito di stimolazione con anti-CD3/CD28. La quantificazione dell'RNA ASP è stata possibile anche in pazienti sottoposti ad ART, con viremia non rilevabile.In due pazienti su tre, l'RNA ASP è stato rilevato in bassi livelli a tre o cinque giorni dopo la stimolazione. Due pazienti sono stati analizzati per ASP e env RNA, uno non trattato e uno trattato. Per il paziente non trattato, entrambi gli RNA potrebbero essere rilevati.Per il paziente trattato, ASP e env erano a malapena rilevabili dopo diversi giorni di stimolazione. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la denaturazione linearizza l'RNA in modo che le strutture secondarie in grado di innescare RT siano distrutte. Mentre, il lavaggio delle perline lava via i cDNA non biotinilati.Dopo la purificazione dei cDNA con la polarità corretta, qPCR può essere eseguito per analizzare l'espressione genica. Inoltre, i cDNA possono anche essere clonati e utilizzati per l'analisi delle sequenze. Questo metodo consente di studiare i geni che si sovrappongono con orientamento opposto e può essere utile per chiarire la regolazione e la patogenesi di un batterio e di una malattia correlata al virus, compresi alcuni tipi di cancro.

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Tropismo dell'HIV può essere dedotta dalla regione V3 della busta virale. V3 è amplificato mediante PCR in triplice copia tramite nested RT-PCR, in sequenza, e interpretato utilizzando il software bioinformatico. I campioni con con sequenza di 1 o più (s) con punteggi bassi G2P sono classificati come non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di...

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

Quantificare i livelli di HIV-1 RNA nel plasma e sequenziamento singolo HIV-1 genomi di individui con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità (50-75 copie / ml) è difficile. Qui si descrive come estrarre e quantificare l'RNA virale plasmatico usando un test PCR in tempo reale che misura affidabile HIV-1 RNA fino a 0,3 copie / ml e come amplificare genomi virali mediante sequenziamento del genoma unico, da campioni con una carica virale molto bassa.

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Test di resistenza ai farmaci per l'HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione.

Un metodo di monitoraggio Affordable HIV-1 resistenza ai farmaci per le impostazioni limitate risorse

La presenza di HPV ad alto rischio in testa e del collo tessuto tumorale è associata a esiti favorevoli. L'RNA recentemente sviluppato nella tecnica di ibridazione in situ chiamata RNAscope permette la visualizzazione diretta di HPV E6/E7 mRNA in sezioni di tessuto FFPE.

RNAscope per<em&gt; In situ</em&gt; Rilevamento di trascrizionale attivo Papillomavirus Umano in Cervico Carcinoma a cellule squamose

La competizione di crescita tra virus quasi isogenici fornisce una misura sensibile per determinare l'idoneità alla replicazione relativa. I protocolli qui descritti includono la costruzione di cloni ricombinanti di HIV-1, la competizione per la propagazione e la crescita del virus e metodi di analisi ottimizzati per produrre risultati sensibili e coerenti.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

Provided è un protocollo per lo sviluppo di un test di amplificazione della polimerasi ricombinasi in tempo reale per quantificare la concentrazione iniziale di campioni di DNA utilizzando un termociclatore o un microscopio e un riscaldatore per tavolini. Viene anche descritto lo sviluppo di un controllo positivo interno. Vengono forniti script per l'elaborazione di dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

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Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

Scopri un metodo RT-PCR strand-specifico per rilevare trascritti antisense di HIV-1 ASP nei pazienti. Questa tecnica utilizza primer biotinilati e alte temperature di denaturazione per amplificare cDNA antisense con elevata specificità.

Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand (Video) | JoVE Journal

Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand

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