שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

תרמופורזה מיקרומטרית בעלת תווית מיקרו-קנה מידה מקבלת קבועי ניתוק, או KDs, של אינטראקציות ביוכימיות מגוונות ביעילות. פרוטוקול זה ואת הווידאו הנלווה לתת את הזיקה המשוערת עבור Vam7, חלבון SNARE המסיס היחיד בשמרים, לחומצה פוספטידית. זוהי הדרך שבה Vam7 מקשר עם שתי ממברנות לפני אינטראקציה עם חלבונים אחרים.

שיטה זו משיגה KDs במהירות עבור אינטראקציות ביוכימיות מגוונות בעלות נמוכה, עם רבייה גבוהה ועם עלות חלבון מינימלית. טכניקה זו מתאימה לפיתוח תרופות בשלב הראשון, ומאפשרת KDs בר השגה בקלות כדי לקבוע תרכובות עופרת פוטנציאליות. לפני תחילת ניתוח, הפעל את מתג ההפעלה בגב התקן MST ופתח את תוכנת הבקרה.

ודא שהמחשב מחובר להתקן ובמצב מחובר והגדר את MST לפני ל- 3 שניות, את ה- MST ל- 30 שניות ואת שחזור הפלואורסצנטיות לאחר שנייה אחת. עבור כל צינור נימי, הזן את השם של ליגנד היעד, את השם של ניתוח ליגנד, את הריכוז של היעד, ואת ריכוז titration הגבוה ביותר באמצעות יחס טיטרציה מילוי אוטומטי. בחר טווח של כוחות MST והזן ערכים עבור כל כוח כדי לבדוק את התאמת האיגוד החזקה ביותר.

כדי להכין דגימות MST שכותרתו, לדלל פתרון Vam7-octahistidine לריכוז 200 ננומולרי וצבע NTA-Atto 647 לריכוז 100 ננומולרי, שניהם PBS. מערבבים את Vam7-octahistidine ואת צבע NTA-Atto 647 ביחס נפחי של 1:1 ולאפשר לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את תערובת הצבע והחלבון ולאחסן את הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס עד כמה שעות לפני השימוש.

לאחר מכן, להכין את המדגם, לקחת ליגנד צבוע ולחשוף את הניתוח. לקבלת תרמופורזה מיקרומטרית של המדגם, פתח את ההתקן והחלק את מתלה הנימים החוצה. טען את נימי המדגם לתוך המדף עם הריכוז הגבוה ביותר במיקום אחד ובחר את הערוץ האדום בתוכנת הבקרה.

לאחר מכן, טען את המתלה בכלי. לאחר מכן בחר טווח של כוח MST והתחל את מדידת MST סריקת Cap והערך את תגובת ההזזה. עקבות תרמופורטיים מניסוי אחד של 1:1 titration של DiC8 PA החל מ 500 מיקרומולה נגד 50 ננומולר NTA-Atto 647 שכותרתו Vam7 תחום מוצגים כאן.

הפלואורסצנטיות הראשונית, קפיצת הזמן והתרמופורזה ניתן לראות, המאפשר KD להיות מחושב מכל אחד או שילוב של מדידות אלה. עקומת רוויה ניתן להתוות מתוצאות אלה, למשל, עבור התרמופורזה עם פלט קפיצת הזמן, כפי שמודגם בגרף. בדרך כלל, תוצאות MST נקבעות באמצעות קנה מידה יומן, תוך התחשבות בריכוז החלבון כדי לקבוע את הזיקה המחייבת על ידי בחירת מודל KD והזנת ריכוז החלבון.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, ודא כי הפתרון נמצא במרכז הנימים וכי אין בועות אוויר וכי נימי אין אבק או פתרון בצד החיצוני של נימי. קלורימטריה איזותרמית טיטרציה או תהודה פלסמון פני השטח יכול לשמש כדי לאמת את KD הניסיוני שהושג. אם קיים איגוד שיתופי פוטנציאלי, ITC תהיה השיטה הלוגית הבאה שבוצעה, בהינתן משאבים.

טכניקה זו אפשרה לחוקרי ביולוגיה מסורתיים לשלב טכניקות סינון ביופיסיות במחקר שלהם לקביעת יחסי מסלול. דוגמה אחת לטכניקה זו היא lysase תא עם חלבון היעד לידי ביטוי אנדוגני, שבו תג GFP הוא דרך חדשנית לבצע בדיקה מושכת למטה מסורתית.