Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle

Notre méthode permet l’étude des vaisseaux sanguins situés dans des structures qui seraient autrement difficiles à imager à Vivo, comme l’hippocampe. Puisque les vaisseaux sanguins sont enlevés du tissu cérébral, la signalisation entre les capillaires et l’artériole peut être étudiée sans effets hors cible sur le tissu environnant. Pour isoler l’hippocampe, utilisez de petits ciseaux de dissection pour couper la peau le long de la ligne médiane en haut de la tête de la souris et déplacer la peau sur les côtés.

À partir du côté caudal du crâne, couper le crâne le long de la ligne médiane jusqu’à ce que les bulbes olfactifs sont atteints et enlever des parties du crâne jusqu’à ce que le cerveau soit exposé. À partir du nez de la souris, retirez lentement le cerveau, en utilisant les ciseaux pour couper à travers les bulbes olfactifs, les nerfs crâniens et la moelle épinière. Submergez le cerveau, côté ventral vers le bas dans mops tamponné saline, au centre d’une plaque de dissection, et placez la plaque sous un microscope de dissection.

En tenant le bord tranchant parallèle au fond du plat, utilisez la lame de rasoir pour couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale en un seul coup. Placez un hémisphère au centre de la plaque avec la ligne médiane orientée vers le bas et poussez la lame de rasoir directement à travers le tissu le long de la fissure transversale pour enlever le cervelet et le tronc cérébral. Faites pivoter l’hémisphère de sorte que le côté médial soit orienté vers le haut et utilisez une spatule pour maintenir le cerveau en place.

Insérez la pointe d’une deuxième spatule sous le corpus callosum, en ramassant sous le tissu pour enlever le thalamus, le septum et l’hypothalamus de l’hippocampe. L’hippocampe doit maintenant être visible comme une structure incurvée près du côté postérieur du cerveau. À l’aide d’une spatule pour maintenir le cerveau en place, utilisez la deuxième spatule pour sortir l’hippocampe du cerveau.

Ensuite, transférez l’hippocampe dans une nouvelle plaque de dissection, remplie à mi-chemin d’une nouvelle solution MOP. Pour l’isolement hippocampal d’artériole, placez de petites broches à chaque extrémité d’un hippocampe pour fixer le côté hippocampal d’échantillon vers le haut. À l’aide de forceps très tranchants, étirer délicatement de petites sections de l’hippocampe pour desserrer le tissu entourant les artérioles.

Et fouiller dans les tissus hippocampaux dorsal pour identifier les artères transversales externes. Lorsque l’artère a été localisée, saisir l’artère transversale externe de l’hippocampe et lentement l’éloigner du tissu pour recueillir les artérioles et capillaires. L’artère de chaque hippocampe est enlevée séparément.

Lorsqu’il n’y a plus de vaisseaux à enlever, placez les échantillons sur la glace et jetez le tissu hippocampal restant. Pour la cannulation des artérioles, localiser et artériole avec une branche qui se termine par des capillaires et placer l’artériole dans une chambre d’orgue. Poussez soigneusement la pointe de la canule à travers la paroi artériole sous la zone cible pour monter le vaisseau sanguin.

Ensuite, glissez soigneusement le récipient sur la canule jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de tissu sur lequel placer la cravate. Utilisez des sutures en nylon 12-0 pour faire un nœud lâche qui s’adaptera au-dessus du vaisseau sanguin et de la canule, et utilisez un demi-nœud d’attelage pour fixer les traverses, tirez les extrémités pour serrer le noeud pour fixer l’artériole à la canule. Fixez une autre cravate à l’autre extrémité de l’artériole pour la sceller.

De l’autre côté de la chambre, abaisser une deuxième canule jusqu’à ce que le point de la canule épingle la cravate à l’extrémité de l’artériole. Ensuite, utilisez une troisième canule pour épingler la branche capillaire à la couverture, en plaçant la pointe près de l’extrémité de la branche, tout en laissant les extrémités des capillaires exposés. Comme la microcirculation du cerveau est extrêmement fragile, assurez-vous de minimiser l’étirement et la manipulation des vaisseaux pendant la procédure de cannulation pour assurer la survie des artérioles.

Pour l’analyse de la myographie sous pression, transférez la chambre à un stade de microscope léger avec un logiciel d’enregistrement et connectez le tube d’entrée et de sortie à la chambre pour profusion. Commencez la profusion avec 37 degrés Celsius Fluide céphalo-rachidien artificiel à une vitesse d’écoulement de quatre millilitres par minute, et fixez la canule de pression à la pompe périssaltique jumelée à un transducteur de pression. Apportez la pression interne à 20 millimètres de Mercure et démarrez le logiciel d’enregistrement.

Ajustez le microscope et les paramètres de l’image pour obtenir l’image la plus claire possible. Et utilisez le logiciel Edge Detection pour vérifier que l’artériole mesure environ 15 à 30 micromètres de diamètre lorsqu’il est entièrement dilaté. Une fois les paramètres optimisés, commencez l’enregistrement et augmentez la pression intravasculaire dans le vaisseau jusqu’à 40 millimètres de Mercure, tout en enregistrant le diamètre de l’artériole avec le logiciel edge detection.

Ensuite, profuse de la chambre pendant 15 à 20 minutes pour laver la solution MOP. Pour tester la viabilité du navire, appliquer une solution micromolaire NS309 à la profusion de bain, le segment artériole devrait se dilater, démontrant un ton myogénique de 30 à 40%. Une fois que le ton de base pour l’artériole a été établi, utilisez un tireur de verre pour faire des canules avec un point fin à une extrémité, et utilisez des forceps pour briser la pointe de chaque canule, de sorte que le médicament d’intérêt peut couler en douceur à travers la pointe à cinq livres de pression par pouce carré.

Remplissez la canule avec le médicament d’intérêt. Et chargez la canule sur un micromanipulateur à trois axes fixé au microscope. Connectez le tube du système d’éjection de pression à la canule, et abaissez lentement la canule dans le bain près des capillaires, en prenant soin de ne frapper aucune partie du navire ou de la chambre.

Pour stimuler les capillaires, abaissez la canule au coverslip juste à côté des capillaires et activez le système d’éjection de pression avec le temps d’éjection désiré. À la fin de la stimulation, augmenter légèrement la canule pour éviter d’autres stimulations. Pour confirmer que seuls les capillaires étaient stimulés, remplissez la nouvelle canule d’un micromolaire de la solution NS309 et stimulez les capillaires comme démontré.

Obtenez ensuite la vasodilatation maximale en baignez la préparation avec la solution sans calcium. L’application de bain d’un micromolar NS309 cause une dilatation presque maximale de l’artériole due aux canaux potassium calcium-sensibles dans l’endothélium. Les cellules endothéliales capillaires, cependant, manquent de canaux de conductance intermédiaires et petits et ne hyperpolarisent pas en réponse à l’agoniste, par conséquent, stimuler les extrémités capillaires avec NS309, ne provoque pas de dilatation artériar en amont, ce qui indique que NS309 n’a pas atteint l’artériole, et peut être utilisé comme un contrôle pour accéder à la restriction spaciale du composé appliqué sur les capillaires par éjection de pression.

Utilisant la préparation parenchyle parenchymale hippocampale d’arteriole comme démontré, l’application d’un fluide céphalo-rachidien artificiel complété avec le potassium de millimolar aux extrémités capillaires, a comme conséquence une dilatation artéririolaire en amont qui ne diffère pas entre les préparations des souris mâles et femelles. En outre, l’ajout de l’inhibiteur Kir2 ML 133, abolit pratiquement la dilatation artériole induite capillaire, en réponse à 10 millimolaires de potassium dans les préparations de souris mâles et femelles. Lors du montage de la véselle sanguine, limitez les interactions directes avec le vaisseau sanguin afin de minimiser les dommages et d’accroître la viabilité du vaisseau.

Une fois que le vaisseau sanguin a été isolé, différents composés de drogue peuvent être examinés ou le vaisseau sanguin peut être davantage traité pour la biologie oléculaire, l’immunochimie, ou les études d’électrophysiologie.