Name: Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri un protocollo robusto per studiare l'accumulo di α-sinucleina in neuroni dopaminergici primari di topo usando fibrille preformate. Questo metodo automatizzato facilita lo screening ad alto throughput di potenziali farmaci per la malattia di Parkinson.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La diffusione della patologia lewy, di cui il pS129-ssyn è un elemento costituente principale, è un segno distintivo istopatologico della PD. L'arresto o il rallentamento dell'accumulo di pS129-syn aggregati può rallentare la degenerazione dei neuroni della dopamina e la progressione della alfa-sinucleinopatia. Tuttavia, una comprensione meccanicistica di come l'aggregazione di pS129-ssyn contribuisce alla scomparsa dei neuroni della dopamina deve ancora essere stabilita. Le evidenze di studi postmortem umani su campioni cerebrali da pazienti in diversi stadi della malattia, nonché l'osservazione dell'inclusione positiva di pS129-zsyn nei neuroni fetali trapiantati suggeriscono fortemente la diffusione della patologia lewy tra le cellule16,17,33. Di conseguenza, la diffusione di pS129-ssyn è stata recentemente ricapitolata utilizzando FPF9,,10. La creazione di un modello robusto, conveniente, e relativamente ad alta o media velocità di diffusione e accumulo di pS129-zsyn, in particolare nei neuroni della dopamina, può accelerare notevolmente la ricerca di nuovi trattamenti e composti che modificano questo processo.
Perché la perdita di neuroni della dopamina è la causa principale dei sintomi motori nella PD e queste cellule possiedono molte proprietà uniche2,34,35, modellazione della diffusione prion-like di pS129- ssyn nei neuroni della dopamina è il tipo più rilevante di modello dal punto di vista traslazionale. I protocolli che utilizzano micro colture di isole di neuroni midbrain embrionali su 4 placche e quantificazioni semiautomatiche sono stati descritti in precedenza18. Il protocollo qui descritto è stato adattato a 96 lastre di pozzo e fornisce una preparazione meno laboriosa di micro isole, consentendo la preparazione di un massimo di quattro piastre contenenti 60 pozze ciascuna da un ricercatore esperto durante una giornata lavorativa. Coltura di neuroni della dopamina in 96 piastre bene consente di testare i farmaci a quantità inferiori e consente alti tassi di trasduzione con vettori lentivirus. È anche possibile combinare diversi trattamenti per eseguire esperimenti più complessi.
Prima di applicare qualsiasi trattamento (compresi i PFF), la qualità della coltura deve essere verificata con la microscopia a campo luminoso. Se il sistema di microscopia non utilizza una camera di CO2 con riscaldamento, le cellule non devono essere tenute al di fuori dell'incubatrice per più di un paio di minuti, perché i neuroni primari della dopamina del topo sono delicati e facilmente stressati. Per lo stesso motivo, si consiglia di fare la prima imaging dopo 24 h di incubazione (tra DIV1-DIV3). Le cellule dovrebbero sembrare vive con i corpi cellulari presenti e si diffondono omogeneamente all'interno della micro isola. I neuroni primari si sarebbero stabilizzati sul terreno rivestito di PO e hanno iniziato a stabilire proiezioni neuronali. È possibile osservare piccoli grumi di cellule (cioè diametro inferiore a 150-200 m) che possono essere formate se il processo di triturazione non viene eseguito correttamente o la densità di placcatura è superiore a quella raccomandata. Questi piccoli grumi non influenzerebbero l'esperimento, a meno che non siano più di pochi per bene e / o più grande. Le cellule raggruppate rendono molto difficile identificare i marcatori immunoistochimici e le singole cellule durante l'analisi dell'immagine. È essenziale evitare tali grumi mediante un'attenta rivestimento, trituratura e controllo della densità di placcatura. Se l'uniformità di queste condizioni non può essere osservata in alcuni pozzi, non includere questi pozzi difettosi nell'esperimento. Tale esclusione dovrebbe essere effettuata prima dell'esecuzione di qualsiasi trattamento.
Inoltre, l'utilizzo di 96 lastre di pozzo consente un comodo uso di pipette multicanale durante le procedure di colorazione e la visualizzazione diretta con microscopi a piastre automatiche, aumentando ulteriormente la produttività. L'utilizzo della quantificazione automatica delle immagini è indispensabile per l'analisi dei dati provenienti da piattaforme di imaging ad alto contenuto. Oltre alla capacità di elaborare migliaia di immagini ottenute da ogni esperimento, garantisce una quantificazione imparziale e identica di tutti i gruppi di trattamento. Il flusso di lavoro proposto per l'analisi dell'immagine si basa su semplici principi di segmentazione dei neuroni della dopamina, filtraggio delle cellule segmentate correttamente mediante l'apprendimento automatico supervisionato e successivamente la quantificazione dei fenotipi (pS129-syn positivo e pS129-'syn negativo), sempre dall'apprendimento automatico supervisionato. Anche se diversi approcci diversi per questo compito possono essere immaginati, abbiamo trovato la combinazione di segmentazione con l'apprendimento automatico per essere il più robusto per le colture di dopamina a causa di alta densità di placcatura, le diverse forme di neuroni della dopamina, e la presenza di neuriti fortemente macchiati. L'algoritmo di analisi delle immagini proposto è stato implementato in CellProfiler e CellProfiler Analyst, open source, software di analisi delle immagini ad alto contenuto liberamente disponibile26,27. L'algoritmo potrebbe anche essere implementato con altri software di analisi delle immagini, sia open source (ad esempio, ImageJ/FIJI, KNIME) o proprietario. Tuttavia, nella nostra esperienza queste funzionalità di personalizzazione spesso sacrificano per facilità d'uso, e quindi potrebbero non funzionare bene in analisi complicate. Abbiamo scoperto che i pacchetti software CellProfiler e CellProfiler Analyst forniscono risultati particolarmente affidabili combinando un numero considerevole di algoritmi implementati, estrema flessibilità nella progettazione del flusso di lavoro e la gestione simultanea e l'elaborazione efficiente dei dati di imaging ad alto contenuto.
Il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato per la quantificazione di altri fenotipi cellulari caratterizzati dall'immunostaining con diversi anticorpi, come marcatori di altre popolazioni neuronali (ad esempio, DAT, GAD67, 5-HT ecc.) e aggregati proteici (ad esempio, fospo-Tau, ubiquitina). Più marcatori fluorescenti potrebbero anche essere combinati per distinguere fenotipi multipli (ad esempio, cellule con inclusioni in diverse fasi di maturazione). La classificazione automatizzata di fenotipi multipli dovrebbe anche essere facile da implementare nelle pipeline di analisi delle immagini descritte semplicemente aggiungendo un canale contenente immagini immunofluorescenti di marcatori aggiuntivi per le fasi di misurazione e l'ordinamento delle cellule in più contenitori. L'utilizzo di più marcatori contemporaneamente richiederebbe tuttavia l'ottimizzazione delle condizioni di immunostaining e imaging. Inoltre, per una migliore qualità nell'imaging immunofluorescenza, si raccomanda l'uso di speciali piastre da 96 pozze con pareti nere esplicitamente progettate per il microscopio fluorescente. Tuttavia, questi possono essere notevolmente più costosi rispetto alle piastre di coltura cellulare standard, che sono sufficienti per l'analisi descritta nel nostro protocollo.
Il tipo e la qualità dei PFF utilizzati sono fondamentali per il risultato degli esperimenti. I PFF possono influire sia sulla robustezza del saggio che sull'interpretazione dei risultati. Le condizioni di preparazione potrebbero influenzare l'efficienza di seeding dei PFF e, in effetti, sono stati segnalati "ceppi" Di PFF con diverse proprietà fisiologiche36. Ciò nonostante, la preparazione e la convalida dei PFF esulano dall'ambito di questo articolo e sono state descritte in diverse pubblicazioni11,28,29,30. Oltre al protocollo di preparazione, la specie di origine della sinucleina di synucleina nei PFF (ad esempio, topo, umano) e l'uso di proteine di tipo selvatico o mutate (ad esempio, a53T umano - sinucleina) devono essere considerate, a seconda delle particolari condizioni sperimentali. L'induzione dell'accumulo di pS129-ssyn da parte dei PFF è risultata dipendere dall'età della coltura (cioè, giorni in vitro), con colture più mature che mostrano un'induzione più pronunciata11. Ciò è probabilmente dovuto all'aumento del numero di connessioni neuronali in colture più mature, e all'aumento dei livelli di proteine di sionucleina. Nelle nostre mani, il trattamento con PfF a DIV8 ha dato i risultati più robusti, con un accumulo pronunciato di pS129- ssyn nel soma del neurone della dopamina, pur non compromettendo la sopravvivenza neuronale. Il protocollo descritto è adatto allo studio di trattamenti che modificano i primi eventi che portano all'aggregazione di endogenine z-sinucleina perché quantifichiamo le inclusioni positive di pS129-zsyn in un momento relativamente precoce, 7 giorni dopo l'inoculazione con i PFF. A questo punto, le inclusioni intrasomiche sono presenti in una frazione significativa di cellule e possono essere facilmente distinte dall'immunostaining mentre non si osserva la morte cellulare indotta dal PFF, semplificando l'interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, poiché la morfologia e la composizione delle inclusioni indotte da PFF possono cambiare nel tempo12,,13, il protocollo descritto potrebbe, in linea di principio, essere modificato per studiare inclusioni più mature per fissazione e immunostaining nei punti successivi. Tuttavia, mantenere i neuroni della dopamina in coltura per più di 15 giorni richiede estrema cura, e potrebbe indurre ulteriore variazione a causa di cellule che non riescono a sopravvivere indipendentemente dall'inoculazione PFF. Inoltre, colture più estese complicano i programmi di trattamento farmacologico. Molti composti hanno limitato o non mal caratterizzato stabilità nel mezzo di coltura cellulare, e il rifornimento di un farmaco non è banale perché lo scambio completo di mezzo compromette la sopravvivenza delle culture della dopamina.
La fosforolante della synucleina a Ser129 è costantemente riportata nei modelli basati sul PFF dell'aggregazione z-sinucleina e colocalizza con marcatori di misfolding e aggregazione come Thioflavin S, ubiquitina o anticorpi specifici della conformazione11,12. Nelle nostre mani, l'immunostaining per pS129-zsyn dà anche il segnale più forte con lo sfondo più basso ed è più semplice da analizzare, dando risultati robusti quando più trattamenti vengono sottoposti a screening. È importante sottolineare che l'immunostaining con anticorpo pS129-ssyn non rileva i PFF che rimangono al di fuori delle cellule, riducendo significativamente lo sfondo. Tuttavia, è importante ricordare che la fosfororylazione Ser129 è probabilmente uno dei primi processi collegati al misfolding di synuclein e potrebbe essere regolata in modo diverso in condizioni specifiche. Pertanto, tutti i risultati che mostrano effetti positivi su pS129-ssyn dovrebbero essere confermati da altri marcatori.
L'analisi statistica dovrebbe essere adattata in base alla progettazione sperimentale. È essenziale effettuare esperimenti in almeno tre repliche biologiche indipendenti (cioè colture neuronali primarie separate). Queste repliche devono essere placcate su piastre diverse e trattate in modo indipendente. Analizziamo i dati ottenuti da repliche su diverse piastre con design a blocchi casuali ANOVA37 per tener conto dell'abbinamento dei dati per diverse piastre sperimentali.

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla morte dei neuroni della dopamina midbrain nella sostanziale nigra (SN), successiva perdita di tono della dopamina nei gangli basali e conseguenti disturbi motori1,2. Una caratteristica istopatologica importante nel cervello dei pazienti affetti da PD sono gli aggregati intracellulari di proteine/lipidi trovati nel soma neuronale, chiamato corpi Lewy (LB), o nei neuriti, neuriti di Lewy (LN), collettivamente noti come patologia Lewy3. La patologia lewy nel cervello sembra progredire con l'avanzamento della PD simile alla diffusione di fattori patogeni attraverso connessioni neuronali. Abbondante patologia Lewy si trova nei neuroni della dopamina nel SN e le cellule in altre aree colpite da neurodegenerazione4. Tuttavia, durante la progressione della malattia, la diffusione e l'insorgenza dell'aggregazione proteica non sempre sono correlate alla morte neuronale e l'esatto contributo della patologia lewy alla morte neuronale non è ancora chiaro5.
LB e LN erano stati indicati per essere costituiti da componenti membranosi e proteici3. I primi sono frammenti di membrana, strutture vescicolari (forse lisosomi e autofanosomi) e mitocondri3. Quest'ultimo è costituito da almeno 300 diverse proteine6. Uno studio di Spillantini et al.7 ha dimostrato che la principale componente proteica della patologia di Lewy è la sinucleina. Altamente espresso nei neuroni, e collegato con la fusione della membrana e il rilascio del neurotrasmettitore, la z-sinucleina nella patologia di Lewy è presente per lo più in forma di fibrilla mile ariamiide, la maggior parte dei quali è fosforolato a Ser129 (pS129- ssyn)4,8.
È importante sottolineare che, a causa delle sue proprietà simili a prioni, le funzioni di synucleina piegate in modo improprio potrebbero avere un ruolo causale nella formazione patologica di Lewy4. Le proprietà prion-like di misfolded synuclein sono state mostrate con estratti midbrain da pazienti e fibrille preformate di tipo sisianone (PfF) preparate in modo corretto per indurre aggregati di sinucleina in neuroni in coltura e in vivo9,10. I PFF presentano un modello affidabile e robusto per studiare la progressione della patologia di sinucleina z nei neuroni della dopamina. Quando i PfF vengono applicati ai neuroni primari coltivati o iniettati nel cervello animale, portano alla formazione di inclusioni contenenti z-sinucleina nei neuriti e nel soma cellulare11 che ricapitolano molte caratteristiche osservate nella patologia di Lewy. Le inclusioni osservate sono detergenti insolubili nel Tritone X, ubiquitinated, macchiate con la colorante specifica amiloide Thioflavin S e contengono iperfosforoslato a z-synuclein a Ser12911,12. È importante sottolineare che queste inclusioni non si formano negli animali da urlo di tipo11di synucleina , indicando la dipendenza della loro formazione sulla sinucleina endogena.
Tuttavia, è difficile confrontare direttamente le inclusioni indotte da PFF e la patologia Lewy riscontrata nei pazienti affetti da PD perché le LB e le LN umane sono altamente eterogenee3. L'eterogeneità osservata della patologia lewy potrebbe essere causata da diverse fasi della formazione, da diverse posizioni anatomiche o da differenze nella conformazione di misfolded z-sinucleina che iniziano il processo di aggregazione. Gli stessi fattori potrebbero influenzare le inclusioni positive di pS129-syn indotta da PFF. Infatti, recentemente è stato dimostrato che le inclusioni positive pS129-syn indotte da PFF nelle colture neuronali primarie rappresentano fasi molto iniziali della patologia che possono maturare in strutture molto simili a LB dopo un periodo di incubazione prolungato12,13.
Modellare la diffusione precoce e l'accumulo di errori di tipo synucleina con i PFF è prezioso per lo sviluppo di farmaci, poiché la diffusione della patologia di Lewy è considerata uno dei marcatori della malattia in fase iniziale. Pertanto, i trattamenti di prevenzione delle aggregazioni possono essere promettenti per fermare o rallentare la progressione della PD nelle fasi molto precoce. Sono in corso diversi studi clinici volti a rallentare o fermare l'accumulo di sinucleina14. Per i pazienti in fase successiva, il trapianto di progenitori neuronali della dopamina può essere una migliore alternativa di trattamento15. Tuttavia, la patologia Lewy è stata documentata nei neuroni embrionali trapiantati durante l'analisi post-mortem dei cervelli dei pazienti della PD16,17, indicando anche la necessità di protezione contro l'accumulo di sinucleina.
In vitro, i PFF di sivinucleina sono noti per indurre l'aggregazione in linee cellulari immortalate, o più comunemente, nei neuroni ippocampali primari roditori o corticali. Nessuno di questi sono vicini a ricapitolare i neuroni della dopamina10. Coltivare questi neuroni richiede placcatura densa di alcuni numeri di neuroni in vitro18. Per ottenere un'elevata densità di placcatura con materiale limitato (ad esempio, neuroni primari della dopamina), il metodo di coltura micro isola è comunemente utilizzato. Nel microisolato, le cellule sono inizialmente placcate in una piccola goccia di media (di solito alcuni microlitri) tenute insieme dalla tensione superficiale nel mezzo di un grande pozzo18. Dopo che i neuroni si attaccano, l'intero pozzo viene riempito con il mezzo mentre le cellule rimangono confinate ad alta densità nella piccola area di placcatura. Oltre ad ottenere un'elevata densità di placcatura, le micro isole impediscono anche la placcatura vicino ai bordi dei pozze, dove le variazioni nella densità cellulare e nella sopravvivenza sono frequenti. Le micro isole sono spesso utilizzate in pozzi o piatti relativamente grandi; tuttavia, stabilire colture neuronali midbrain in microisole in 96 formato ben piastra consente lo studio della patologia di Lewy in neuroni della dopamina in buona fede con potenza di medio-alto rendimento. Gli esperimenti in vitro con questi neuroni ci hanno permesso di scoprire il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), che promuove la sopravvivenza dei neuroni della dopamina maturi in vitro e in vivo19,20,21,22e impedisce anche la formazione di aggregati di sibita nella dopamina23.22 I neuroni della dopamina derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente umano costituiscono un modello più accurato a causa della loro origine umana e del più lungo tempo di sopravvivenza in vitro. Tuttavia, l'induzione della patologia di sinucleina nei neuroni umani è osservata dopo più mesi, rispetto a una settimana nei neuroni embrionali del topo e/o con più fattori di stress (ad esempio, combinazione di sovraespressione di synucleina e PFF)24,25. Inoltre, il mantenimento dei neuroni della dopamina umana è più costoso e laborioso rispetto ai neuroni embrionali primari, limitando essenzialmente il loro uso in applicazioni ad alta velocità.
Inoltre, le colture neuronali primarie della dopamina possono essere geneticamente modificate (ad esempio, con CRISPR/Cas9) e/o trattate con agenti farmacologici23. Costituiscono una piattaforma veloce e riproducibile per applicazioni come la dissezione delle vie molecolari e lo screening della libreria dei farmaci. Anche se da queste colture è possibile ottenere materiale limitato, è ancora possibile condurre analisi genomiche/proteomiche di piccole dimensioni. Coltivare i neuroni primari in 96 benno è meglio per le tecniche di immunocitochimica e microscopia a fluorescenza, seguita da analisi fenotipo ad alto contenuto. Le immagini a fluorescenza multispettrale derivate dall'imaging automatizzato di 96 lastre di pozzo possono essere convertite in risultati quantitativi (ad esempio, il numero di neuroni contenenti LB per pozzo). Tali analisi possono essere eseguite con software libero, come CellProfiler26,27. Nel complesso, le colture primarie di midbrain embrionali placcate in 96 placche di pozzo forniscono una piattaforma robusta ed efficiente per studiare i neuroni della dopamina e l'aggregazione di sinucleina con l'opportunità di screening del fenotipo ad alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>0,4% Trypan Blue colorante</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>15 ml CELLSTAR Tubo in polipropilene</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>5 M HCl</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cucina multimediale, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki</td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cucina multimediale, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki</td></tr><tr><td>Piastra di visualizzazione a 96 pozzetti (nera)</td><td>PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>99,5% Etanolo (EtOH</td><td>)Altia Oyj, Rajam&auml; ki, Finlandia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AquaSil Siliconatura Fluido</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>TS-42799</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga autoclavata da 1,5 ml</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki Dispositivo di</td></tr><tr><td>sonicazione Bioruptor</td><td>Diagenode, Liegi, Belgio</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+, Mg2+ libero Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Pacchetti software CellProfiler e CellAnalyst</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>software open source gratuito</td></tr><tr><td>Centrifuga 5702</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td>5702000019</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ad altissima risoluzione DeltaVision con tavolo d'aria e armadio</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA</td><td>29254706</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucle (Dnase I)</td><td>Roche, Basilea, Svizzera</td><td>22098700</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>21331 020</td><td></td></tr><tr><td>asino anti-topo AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>asino anti-coniglio AlexaFluor 647</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>asino anti-pecora AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di Dulbecco</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar</td><td>fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>11507582</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Nano Automated Imaging System</td><td>Molecular Devices, San Jose, California, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stati Uniti</td><td>25030... 032</td><td></td></tr><tr><td>topo monoclonale anti-tirosina idrossilasi</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, tedesco</td><td>MAB318</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplemento</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>17502 048</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum</td><td>Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, Stati Uniti</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127 polvere di</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide, 95%</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>pH-Fix, strisce indicatrici fissate a colori</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Germania</td><td>92110</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fospoato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kitchen, Istituto di Biotecnologia, Università di Helsinki</td></tr><tr><td>poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, San Diego, California, USA</td><td>ant-pm-1, ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>filamento monoclonale anti-alfa-sinucleina di coniglio</td><td>Abcam, Cambridge, Regno Unito</td><td>ab209538</td><td></td></tr><tr><td>coniglio monoclonale anti-fosfo-serina129-alfa-sinucleina</td><td>Abcam, Cambridge, Regno Unito</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer</td><td>IKA&reg;-Werke GmbH, Staufen, Germania</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>fattore neurotrofico ricombinante derivato dalla glia umana (hGDNF)</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA o Prospec, Ness-Ziona, Israele</td><td>450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)</td><td></td></tr><tr><td>fibrille preformate (PFFs) di topo alfa sinucleina ricombinante N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>Dono del collaboratore, Prof. Kelvin C Luk</td></tr><tr><td>Research Stereomicroscope System</td><td>Olympus Corporation, Tokyo, Giappone</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>policlonale di pecora anti-tirosina idrossilasi</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, tedesco</td><td>ab1542</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 Automatizzato Contatore cellulare</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>tripsina</td><td>MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Cina</td><td>2199700</td><td></td></tr></tbody></table>

studio pre-formato fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale midbrain dopamine neuroni

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello robusto e riproducibile di accumulo di sivinucleina nei neuroni primari della dopamina. Combinato con l'immunostaining e l'analisi automatizzata imparziale dell'immagine, questo modello consente l'analisi degli effetti dei farmaci e delle manipolazioni genetiche sull'aggregazione di sisnucleina nelle colture neuronali. Le colture primarie di midbrain forniscono una fonte affidabile di neuroni della dopamina embrionale in buona fede. In questo protocollo, il segno distintivo dell'istopatologia del morbo di Parkinson, le corpi di Lewy (LB), è imitato dall'aggiunta di fibrille preformate (FPF) direttamente ai mezzi di coltura neuronale. L'accumulo di fosforeoee endogeno nel soma dei neuroni della dopamina viene rilevato mediante immunostaining già a 7 giorni dopo l'aggiunta di PFF. Le condizioni di coltura delle cellule in vitro sono adatte anche per l'applicazione e la valutazione di trattamenti che prevengono l'accumulo di sinucleina, come farmaci di piccole molecole e fattori neurotrofici, nonché vettori di lentivirus per la manipolazione genetica (ad esempio, con CRISPR/Cas9). Coltivare i neuroni in 96 piastre di pozzo aumenta la robustezza e la potenza delle configurazioni sperimentali. Alla fine dell'esperimento, le cellule sono fissate con paraformaldeide per l'immunocitochimica e l'imaging della microscopia a fluorescenza. Le immagini a fluorescenza multispettrale sono ottenute tramite microscopia automatizzata di 96 lastre di pozzo. Questi dati sono quantificati (ad esempio, contando il numero di neuroni della dopamina contenenti fosforo-sinucleina per bene) con l'uso di software libero che fornisce una piattaforma per l'analisi imparziale del fenotipo ad alto contenuto. La modellazione indotta dal PFF dell'accumulo di fosfore-sinucleina nei neuroni primari della dopamina fornisce uno strumento affidabile per studiare i meccanismi sottostanti che mediano la formazione e l'eliminazione delle inclusioni di sinunucleina, con l'opportunità di screening farmacologico ad alto rendimento e analisi del fenotipo cellulare.

Pochi giorni dopo la placcatura (DIV1-DIV3), la microscopia a campo luminoso è stata fatta per valutare la salute e la diffusione omogenea delle cellule coltivate e l'uniformità di queste condizioni nei singoli pozzi (Figura 3). Le cellule cerebrali cerebrali coltivate si sono diffuse omogeneamente all'interno della microisola creata prima della placcatura (Figura 3A,B). I neuroni primari si erano stabilizzati sul terreno rivestito in modo omogeneo e avevano stabilito proiezioni neuronali (Figura 3B). Un piccolo gruppo di cellule (diametro inferiore a 150 m) è stato osservato al pozzo e mostrato come esempio (Figura 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig03.jpg"> Figura 3: Pochi giorni dopo la placcatura (ad esempio, DIV3), le condizioni delle colture primarie del midbrain sono state osservate con la microscopia a campo luminoso. (A) Le cellule coltivate si diffondono nel mezzo del pozzo all'interno dell'isola micro rivestita di PO con un raggio approssimativo di 4,4 mm (mostrato con frecce bianche) creato grattando PO da circa 1 mm ben perimetrale (mostrato con frecce nere). (B) I neuroni primari coltivati si diffondono omogeneamente all'interno dell'area e sono state osservate proiezioni neuronali (contrassegnate con punte di freccia rossa). (C) Un grumo di cellule con un diametro inferiore a 150 m è contrassegnato con punte di freccia blu. Barre della scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le colture primarie del midbrain sono state immunostainse con anticorpi anti-TH e anti-pS129-zsyn e immagini con un microscopio automatizzato dopo 15 giorni in vitro. Micro isole rivestite fornito area limitata per l'attaccamento delle cellule nel mezzo di pozzi (Figura 4A,B). I neuroni della dopamina immunoetichettati con il marcatore TH si sono diffusi intorno all'isola in un monostrato, separati l'uno dall'altro, senza alcun agglomeramento (Figura 4A' e 4B').
<img alt="Figure 4" class="xfigimg bigfig" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2.jpg"> Figura 4: A DIV15, 800-1.000 cellule della dopamina sono state quantificate da ogni micro isola, con o senza trattamento PFF. Immagini rappresentative di colture embrionali di midbrain immonutuate con anticorpi anti-TH e anti-pS129-zsyn. (A, A', A'') Controllare le cellule senza trattamento PFF. (B, B', B'') Cellule trattate con PFF con inclusioni di pS129-. (C) Quantificazione dei numeri di cellule TH-positivi in pozzi trattati con veicolo (controllo), PFF o PFF con 50 ng/mL GDNF. (D) Quantificazione degli aggregati di pS129-zsyn in cellule TH-positive trattate con veicolo (controllo), PFF o PFF con 50 ng/mL GDNF. La rilevanza statistica è stata calcolata con la progettazione casuale del blocco ANOVA. &lt; 0,01, n - 4 piastre individuali (repliche biologiche), ognuna con 3-6 pozzi per gruppo di trattamento (ripetizioni tecniche). Barre di scala : 300 m per A, B; 50 m per A', B'; 25 m per A'', B''. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mentre le colture senza trattamento PFF non avevano alcun segnale pS129- ssyn(Figura 4A' e 4A''),colture trattateFigure 4Bcon PFF 4B’’a z-sinucleina hanno sviluppato pS129- .’ Il trattamento PFF in vitro per 7 giorni non ha causato alcuna diminuzione significativa del numero di neuroni TH-positivi, rispetto ad altri gruppi sperimentali (Figura 4C). Le colture trattate con PFF avevano una popolazione del 40% dei neuroni della dopamina positivi di pFF129- . Il trattamento con controllo positivo, GDNF, ha ridotto la percentuale di neuroni della dopamina TH-positivi con inclusioni positive pS129-zsyn (Figura 4D, vedere anche i dati grezzi e le immagini di esempio nei file supplementari).
File supplementari: Pipeline di esempio per l'analisi delle immagini ad alto contenuto con CellProfiler e i pacchetti software CellAnalyst, immagini di esempio e dati non elaborati per Figura 4E, F. (1-9) Example_Images. Aprire queste immagini con ImageJ o CellProfiler.Open these images with ImageJ or CellProfiler. (10) Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11) TH_LB_V1.cpipe (Steps 6.2–6.8), (12) TH_LB_V2.cpipe (Steps 6.11–6.18) <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61118/Supplementary_Files.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Questo protocollo fornisce un modello robusto e riproducibile di accumulo di alfa sinuleina nei neuroni della dopamina primaria per studiare i meccanismi e i trattamenti che possono regolare questo accumulo. Le fibrille alfa-sinuleina preformate inducono un accumulo progressivo e altamente riproducibile di proteine combinato con l'imaging automatizzato e l'analisi imparziale delle immagini, questo protocollo facilita uno screening della produttività relativamente veloce, medio-alto dei camion inibitori dell'accumulo di alfa-sinuleina. L'accumulo progressivo di alfa-sinuleina può essere uno dei fattori che compromettono la funzione neuronale nel morbo di Parkinson e in alcuni corpi nucleari.Nuove molecole che bloccano tale accumulo possono diventare nuove terapie per la neurodegenerazione. Crediamo che questo protocollo sia un passo importante per stabilire uno strumento standard e affidabile per studiare i meccanismi molecolari che regolano l'accumulo di alfa-sinuleina nei neuroni della dopamina. A dimostrare la procedura sarà Julia Konovalova, dottoranda del mio laboratorio.Prima di impostare la coltura primaria delle cellule del mesencefalo embrionale, aggiungere 50 microlitri di dopamina, il mezzo neuronale, ad ogni pozzo della piastra del pozzo rivestita in Poli-L-Ornitina 96 e utilizzare una punta di pipetta da 100 microlitri per aspirare il mezzo graffiando contemporaneamente il fondo di ogni pozzo in una direzione circolare per rimuovere il rivestimento sul perimetro di ogni pozzo. Un'isola rivestita in Poli-L-Ornitina rimarrà al centro di ogni pozzo. Aggiungere 10 microlitri di mezzo al centro di ogni isola rivestita per creare micro isole.Creare colture primarie di midbrain embrionali dal giorno embrionale del topo 13,5 embrioni di topo. Mettere in comune tutti i pavimenti a metàbrain raccolti nello stesso tubo da 1,5 millilitri e lavare i campioni tre volte con 500 microlitri di HBSS senza calcio e magnesio per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio sostituire l'HBSS con 0,5% di tripside per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione aggiungere 500 microlitri di una soluzione DNasi I in FBS appena preparata al tessuto parzialmente digerito e utilizzare una pipetta di vetro siliconizzata con punta lucidata a fuoco per triturare il tessuto. Quando si possono osservare solo particelle minuscole e appena visibili, questi frammenti di tessuto si depositano sul fondo del tubo di micro centrifuga e trasferiscono questo supernatante in un tubo di polipropilene conico vuoto da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di HBSS al tubo contenente DNasi I in FBS e mescolare più volte con pipettazione.Trasferire un millilitro di questa soluzione alle particelle di tessuto rimanenti e triturare nuovamente i campioni. Quindi tirare la sospensione cellulare digerita con il tubo di supernatante senza trasferire frammenti di tessuto rimanenti dopo aver triturato il campione di tessuto ancora una volta con la DNasi I e FBS rimanente nei sedimenti HBSS le cellule raccolte per centrifugazione e aspirare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le cellule due volte in due millilitri di mezzo neurone dopamina riscaldato per lavaggio.E rimospendare le cellule a un tre per 10 alle cellule di forza per sei microlitri di concentrazione calda e media fresca in un tubo di micro centrifuga. Quindi rimuovere il mezzo da ogni micro isola preparata in precedenza e mescolare le cellule con una pipetta delicata prima di utilizzare una pipetta da 10 microlitri per aggiungere sei microlitri di cellule a ogni micro isola. Una volta aggiunte tutte le celle, riempire i pozzi vuoti ai bordi della piastra con 150 microlitri di acqua o PBS e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora.Alla fine dell'incubazione aggiungere 100 microlitri di mezzo neurone dopamina fresco ad ogni pozzo e restituire la piastra all'incubatore. L'ottavo giorno di coltura cellulare in una cappa di flusso laminare aggiungere a 3,75 microlitri di 100 microgrammi per millilitro di fibrille preformate ad ogni pozzo sperimentale e 3,75 microlitri di PBS ad ogni pozzo di controllo. Quando si lavora con PFS, essere cauti sulla contaminazione proteica indesiderata e successivamente pulire la cappa e tutti gli strumenti associati al PF con 1%SDS e 70% di etanolo.All'endpoint sperimentale appropriato dopo la colorazione per i marcatori di interesse, caricare la piastra di coltura del pozzo 96 su uno scanner a piastre ad alto contenuto dotato di un obiettivo 10 X. Regolare le impostazioni in base alle specifiche della piastra del pozzo 96 come il tipo di gioco, il produttore, le dimensioni, la distanza tra i pozzi e il tipo e il volume del mezzo. Selezionare l'area di imaging dei pozzi per coprire tutte le celle di ogni micro isola e usarne una nota per regolare la messa a fuoco automatica sull'espressione DAPI.Calibrare il tempo di acquisizione per ogni canale fluorescente in base all'intensità della colorazione nei pozzi di controllo e regolare i parametri in modo che le cellule della dopamina nei pozzi di controllo preformati trattati con fibrillazione che ospitano gli aggregati di fosfoserina 129 alfa sinucleina all'interno del soma cellulare si distinguano chiaramente consentendo una quantificazione inequivocabile delle cellule positive e negative della fosfoserina 129 alfa sinucleina. Quindi immagine di tutti i pozzi selezionati contemporaneamente in tutti i canali utilizzando esattamente gli stessi parametri per ogni pozzo. Per l'analisi delle immagini, aprire l'analista di CellProfiler e selezionare la V2_THpos.proprietà. Per ordinare le celle segmentate in fosfossina 129 cellule positive e negative alfa sinucleina impostare innanzitutto il numero di celle di recupero su 50 celle casuali e fare clic su recupera per caricare le immagini delle celle segmentate. Trascinare almeno 30 celle nella collocazione corrispondente nella parte inferiore della finestra.selezionare utilizzare un potenziamento rapido e delicato con 50 regole max o classificatori di foresta casuali e fare clic su addestra. Impostare fetch su 50 celle positive e fare clic su fetch per acquisire celle di fosfoserina alfa alfa 129 positive di esempio valutate in base al classificatore del treno o impostare fetch su 50 celle negative e fare clic su fetch per acquisire celle di fosfoserina alfa 129 alfa 129 di esempio in base al classificatore del treno. Quando i risultati sono soddisfacenti, fare clic su tutto per generare una tabella dei risultati che riassume il numero di neuroni della dopamina alfa sinucleina alfa sinucleina positivi e negativi in ogni pozzo.Pochi giorni dopo aver placcato una coltura distribuita in modo omogeneo può essere osservata mediante microscopia ottica all'interno della micro isola creata prima della placcatura. I neuroni primari si depositano sul fondo della piastra rivestita in modo omogeneo e stabiliscono proiezioni neuronali. In questa immagine, si può osservare un piccolo ciuffo di cellule di diametro inferiore a 150 micrometri.La colorazione immuno del controllo delle colture primarie di topo non trattate del cervello medio con marcatori cellulari neuronali 15 giorni dopo la placcatura rivela un attaccamento limitato delle cellule all'interno delle micro isole al centro dei pozzi della piastra. Neuroni della dopamina immuno etichettati con marcatore di tirosina idrossilasi sparsi intorno alla micro isola in un monostrato separato l'uno dall'altro senza alcun raggruppamento. Nelle colture trattate con fibrillazione preformata alfa-sinucolaina, si possono anche osservare inclusioni positive di alfa sinuleina pS129.Il trattamento con fibrille preformate in vitro per sette giorni non causa una significativa diminuzione dei numeri positivi di neuroni tirosina idrossilasi rispetto ad altri gruppi sperimentali. Il trattamento con fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale, tuttavia, riduce la percentuale di inclusione positiva di pS129 alfa-sinuleina, ospitando neuroni della dopamina positivi all'idrossilasi tirosina. Prima di creare micro isole, assicurarsi che i pozzali rivestiti in ornitina Poly-L siano saldamente lavati.Assicurati anche di usare nuovi media quando placca nuove culture cerebrali. Il metodo può essere combinato con l'editing genico e gli inibitori farmacologici per studiare gli effetti di specifici geni e onde di pensiero sull'aggregazione del nucleone. Usiamo regolarmente questo metodo per cercare nuove molecole che inibiscono l'accumulo di alfa sinuleina.Hanno dimostrato gli effetti protetti dall'accumulo di TDN e attualmente analizzando diverse piccole molecole candidate.

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Inizia con una coltura primaria del mesencefalo da embrioni di ratto, contenente neuroni dopaminergici che sovraesprimono l'alfa-sinucleina mutata.Sostituire il terreno nei pozzetti di trattamento con un terreno nuovo contenente il composto in esame e quello nei pozzetti di controllo con un terreno semplice. Quindi incubare.Nel controllo, l'alfa-sinucleina forma aggregati tossici nei neuroni dopaminergici, causando la retrazione dei neuriti e portando alla morte neuronale.Nel trattamento, il...

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Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

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Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca2 nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all'attività anormale di Ca2 nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

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