Établissement et entretien des blattes américaines gnotobiotiques (Periplaneta americana)

Le protocole de génération de blattes gnotobiotiques facilite les tests de l’impact de l’élimination et du remplacement de la communauté microbienne intestinale native sur la santé de l’hôte et l’assemblage du microbiome. Cette technique utilise des méthodes provenant de sources multiples pour former un flux de travail cohérent et rationalisé pour générer des cafards gnotobiotiques sans l’utilisation d’équipement de laboratoire spécialisé coûteux. Compte tenu des nombreuses parties mobiles de ce protocole génotobiotique, la visualisation aide les chercheurs à établir plus facilement leurs propres installations génotobiotiques à petite échelle, à faible coût et de paillais.

Pour faciliter la collecte du nombre approprié de femelles transportant des oothèques pour les expériences prévues, utilisez des pinces pour déplacer les tubes en carton contenant des femelles gravides dans le réservoir d’origine. Si un tube en carton contient plusieurs insectes en plus de la femelle gravide, secouez le contenu du tube dans un récipient en plastique supplémentaire entouré de vaseline et encouragez l’insecte cible à remonter seul dans le tube en carton. Lors de la collecte, transférer chaque femelle gravide dans la maternité.

Une fois que les femelles ont laissé tomber leurs oothèques, retournez les femelles dans le réservoir d’élevage et utilisez des pinces pour récupérer les oothèques de la litière. Pour nettoyer les oothèques, placez jusqu’à cinq caisses d’œufs dans un tube de centrifugation de cinq millilitres contenant trois millilitres de dodécyl sulfate de sodium et vortexez les oothèques pendant 10 secondes. Après un deuxième lavage comme cela vient d’être démontré, utilisez une lingette délicate pour frotter doucement la surface de chaque oothèque afin d’enlever les débris et de placer l’oothèque nettoyée dans un bateau de pesage.

Avant la stérilisation, remplissez deux tubes à centrifuger de 1,5 millilitre par oothèque avec un millilitre d’eau stérile par tube. Ajoutez également 10 microlitres de solution mère d’acide peracétique à 32% à 3,2 millilitres d’eau doublement distillée dans un tube de centrifugation de cinq millilitres dans une hotte. Capuchez et inversez plusieurs fois pour mélanger et placer jusqu’à cinq oothèques nettoyées dans la solution d’acide peracétique à 0,1% fraîchement préparée pendant cinq minutes, en inversant le tube plusieurs fois toutes les 60 secondes.

L’acide peracétique est un oxydant puissant, irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires, et est inflammable et corrosif. Portez toujours l’EPI approprié pendant la manipulation et éliminez vos déchets de manière appropriée. À la fin de l’incubation, utilisez une pince stérile et une hotte à flux laminaire pour transférer chaque oothèque dans son propre tube centrifuge d’eau de rinçage stérile.

Inverser plusieurs fois pour mélanger avant de transférer l’oothèque à la deuxième série de tubes d’eau de rinçage. Après le deuxième rinçage, utilisez une pince stérile pour transférer l’oothèque aux inclinaisons individuelles de bhi. Placez les inclinaisons dans un récipient secondaire stérilisé et déplacez le récipient dans un incubateur humidifié de 30 degrés Celsius pendant quatre à cinq semaines jusqu’à ce qu’il éclose.

Vérifiez régulièrement les inclinaisons une à deux fois par semaine pour la croissance fongique ou bactérienne jusqu’à la quatrième semaine, à quel point les inclinaisons doivent être vérifiées quotidiennement. Lorsque les nymphes commencent à éclore, utilisez une pince stérile et une hotte à flux laminaire pour transférer aseptiquement une pastille de chow de rat stérilisé dans une fiole BHI préparée. À titre de vérification de stérilité, placez le ballon dans le récipient secondaire de l’incubateur à 30 degrés Celsius pendant 24 heures pour confirmer l’absence de croissance contaminante.

Si le ballon est resté stérile, secouez les nymphes hors de l’inclinaison, en les laissant tomber dans le ballon dans la hotte à flux laminaire. Ensuite, arrosez les nymphes avec 300 microlitres d’eau stérile une fois par semaine dans la hotte à flux laminaire. Lorsque les excréments de nymphes commencent à couvrir le plancher moyen, transférer les nymphes dans une nouvelle fiole BHI contenant du chow de rat stérilisé ajouté 24 heures à l’avance, comme démontré.

Les femelles gravides peuvent être identifiées par l’oothèque attachée à leur abdomen postérieur. Les oothèques éclosent en moyenne 34 jours après la stérilisation. En cas de stérilisation infructueuse, la croissance peut apparaître autour des oothèques pendant l’incubation, compromettant l’état génotobiotique des nouveau-nés.

Ensuite, le taux de croissance nymphal peut être suivi en mesurant la longueur du corps de l’insecte. Le polymorphisme de longueur de fragment de restriction de l’ADN ribosomal 16S d’une nymphe homogénéisée peut être employé pour confirmer le statut gnotobiotic. Les cafards gnotobiotiques peuvent être inoculés avec des communautés microbiennes synthétiques ou xénobiotiques.

Bien que ce flux de travail particulier soit nouveau, des études antérieures utilisant des cafards gotobiotiques ont généré des informations sur l’assemblage du microbiome intestinal et les rôles microbiens dans la formation du comportement social, de la santé intestinale et de l’immunité de leurs insectes hôtes.