Name: 뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 학습하세요 생쥐 양측 전층 절제 상처 유도 및 조직학적 형태 분석 방법을. 연속 절편을 활용한 정량적 측정으로 치유 결함을 정확히 검출하여 피부 재생 메커니즘 연구에 활용합니다.

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우리는 수년에 걸쳐이 프로토콜의 최적화에 기여 한 던발트 연구소의 모든 구성원과 상처 분석을위한 직렬 단면의 사용을 촉진하는 지속성 지나 샤테만에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH /NIAMS에서 마틴 던발트 (AR067739)에 대한 자금 지원을 받았습니다.

모든 실험은 연방 규정에 따라 완료되었으며 아이오와 대학 정책 및 절차는 아이오와 IACUC 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 동물과 축산
<ol><li>모낭 단계가 텔로겐에있을 때 8-10 주에 원하는 마우스 라인의 성인 마우스를 사용합니다.</li>
	<li>수술 당일, 마우스를 깨끗한 케이지와 개별적으로 집에 분리하여 상처 장애를 최소화합니다.</li>
</ol>2. 수술
참고: 멸균 수술 조건을 유지하는 것은 필요하지 않습니다. 동물 들 간의 멸균을 유지 하기 위해 주의 해야 하는 동안, 펀치 생검 자체는 깨끗 한, 하지만 비 멸균 표면에 이루어집니다. 동물당 수술 기간은 10분에서 15분 사이입니다.
<ol><li>마취<ol>
<li>이소플루란 기화기가 분당 1리터로 설정된 이소플루란 기화기와 함께 유도 챔버에서 1-2분 동안 동물을 마취한다. 대체 마취 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.</li>
		<li>절차를 시작하기 전에 적절한 마취를 확인합니다. 마취의 깊이는 단단한 발가락 핀치에 의해 확인 될 수있다.</li>
		<li>유도 용기에서 코 콘으로 마우스를 옮기고 이소플루란 유량을 1.5%로 줄이고 산소 유량계를 0.5L/min으로 줄입니다.</li>
		<li>절차가 5 분 초과로 양쪽 눈에 안과 연고를 적용합니다.</li>
		<li>열 패드를 사용하여 정상 체온을 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상처 부위 준비<ol>
<li>코달 로스트랄 모션에 전기 면도기 클리퍼를 사용하여 어깨 수준에서 마우스 뒷면의 털을 제거합니다. 두 개 이상의 상처를 수행하는 경우 필요에 따라 뒤쪽의 머리카락을 낮게 제거합니다.</li>
		<li>마우스 뒤쪽으로부터 20°에서 유지된 로스트랄 코골 모션에서 면도날을 사용하여 나머지 모발을 제거하여 잘린부위(그림 1A)를밀접하게 면도합니다.</li>
		<li>면도 부위를 포비도네 요오드 면봉으로 청소하십시오.</li>
		<li>멸균 70% 이소프로필 알코올 준비 패드로 피부를 닦아 요오드 면봉으로 인한 잠재적인 피부 자극을 줄입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부상<ol>
<li>등대 중진선을 따라 견갑골 사이의 피부를 꼬집어 몸에서 끼어 넣은 스킨폴드를 당깁니다(그림1B).</li>
		<li>깨끗한 종이 기반 타월 또는 동등한 로 드레이프 평평한 표면에 스킨 폴드와 측면에 마우스를 배치합니다. 수건 아래에 치과 왁스 시트를 사용하여 기본 표면을 손상으로부터 보호하십시오(그림 1C).</li>
		<li>원하는 크기의 생검 펀치를 가능한 한 신체에 가깝게 놓고 피부가 휴식을 취할 수 있도록 하십시오. 피부를 스트레칭하지 마십시오, 또는 상처 크기는 지정된 펀치 크기(도 1D)보다큽니다.</li>
		<li>아래로 눌러 피부를 펀치, 흔들 운동은 양쪽에 피부의 모든 층이 침투되었는지 확인하는 데 사용될 수있다(도 1E). 각 동물에 대 한 새로운 생검 펀치를 사용 하 여.</li>
		<li>상처에서 펀치 생검을 제거합니다(그림1F). 부착 부위가 여전히 있는 경우 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 주변 피부로부터 펀치를 풀어주세요. 상처 치유 분석을 위한 다운스트림 계획에 따라 필요에 따라 펀치 생검 제어 조직을 처리합니다(제안에 대한 토론 참조).</li>
		<li>초기 상처 부위를 측정하고 분석에서 이상값을 제거하기 위해 상처 부위또는 프레임의 눈금자와 동일한 거리에서 매크로 사진을 찍습니다.</li>
		<li>승인된 동물 프로토콜에 따라 최소 24시간 동안 진통을 투여한다. 예를 들면: Buprenorphine SR-LAB, 통증 완화의 48 h에 대 한 0.5-2 mg/kg에서 피하 로 주사 (대체 제안 및 고려 사항에 대 한 토론 참조).</li>
		<li>그것은 똑바로 자세를 유지하고 케이지 주위에 정상적으로 걷고 될 때까지 마취에서 나오는 마우스를 모니터링합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 상처 후 모니터링
<ol><li>조사자가 결정하고 기관 프로토콜에 따라 실험 종점에 대해 매일 마우스를 모니터링합니다. 예는 다음과 같습니다 : 감염, 눈에 보이는 체중 감소, 또는 구부러진 자세.</li>
	<li>초기 수술 후 수행 된 것처럼 제어 방식으로 매일 매크로 사진을 촬영합니다.</li>
</ol>4. 상처 수확
<ol><li>승인된 동물 프로토콜에 따라 원하는 시점에서 마우스를 재탄화하여 상처 후 후.</li>
	<li>이전 사진수집(그림 2A, C)과일치하는 제어 방식으로 상처 부위의 매크로 사진을 촬영합니다.</li>
	<li>메스(그림2D, E)를사용하여 상처 부위 주위의 넓은 직사각형을 잘라냅니다.</li>
	<li>가위와 핀셋을 사용하여 직사각형 조직을 풀어 서 껍질을 벗기고 기본 조직(그림 2F)에서 피부를 잘라냅니다. 페트리 접시에 놓습니다(그림 2G).</li>
	<li>상처를 수확하십시오. 직사각형 모양으로 상처의 모든 면을 둘러싼 상처가없는 조직의 2mm까지 손질하십시오(그림 2H, I). 상처를 수확하는 대체 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.</li>
	<li>후속 연구에 필요한 상처를 처리합니다. 파라핀 포함 및 조직학적 분석을 위해 마우스당 적어도 하나의 상처를 예약하십시오.</li>
</ol>5. 상처 고정 및 포함
<ol><li>상처 수정<ol>
<li>상처 조직을 4% 파라포름알데히드 용액8에서 실온에서 3시간 동안 수정한 다음 하룻밤 사이에 4°C로 옮겨. 전자 현미경 검사법(EM) 급파라포름알데히드 및 용액 여과가 필요하지 않습니다.</li>
		<li>1x PBS에서 30분 동안 상처를 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>PBS를 70% ETOH로 교체하고 포함될 때까지 4°C에 보관하십시오. 조직학적 특성을 평가하는 경우에만 항원 손실을 피하거나 1-2주 이내에 조직을 처리합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상처를 처리하고 포함<ol>
<li>각 상처를 포함 카세트로 옮기습니다. 이 과정에서 잉크를 제거할 수 있기 때문에 연필에 카세트를 포함시키는 라벨을 부착합니다.</li>
		<li>조직을 수동으로 또는 자동화된 프로세서를 사용하여 에탄올 백분율이 증가하고 자일렌으로 클리어한 다음 파라핀 왁스(표1)로조직에 침투하여 조직을 처리합니다.</li>
		<li>포함 금형의 수평 표면에서 상처 90 ° ("서")를 포함(도 3A, B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 0일 차 감부 분석
<ol><li>NIH-이미지 J 또는 NIH-피지 무료 소프트웨어 (https://imagej.net/Fiji/Downloads)를 다운로드합니다.</li>
	<li>0일 차의 상처 사진이 있는 파일을 엽니다.</li>
	<li>"영역" 아래 "| 확인 측정값을 설정합니다.</li>
	<li>분석 에서"설정 규모"를 선택합니다. 상대측정이 필요한 경우, 소거리에서, 알려진 해당 거리와 거리(= 길이 단위)의 단위(= 길이 단위)를 입력합니다.</li>
	<li>피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.</li>
	<li>상처의 둘레를 간략하게 설명합니다.</li>
	<li>분석아래 측정값을 클릭합니다.</li>
	<li>스프레드시트를 만들어 상처당 동물당 측정값을 추적합니다.</li>
	<li>스프레드시트에서 상처 영역의 측정값을 복사합니다.</li>
	<li>주어진 실험에 대한 모든 상처의 평균 영역과 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>조직학적 분석에서 평균의 두 가지 표준 편차 이외의 상처를 제외합니다.</li>
</ol>7. 직렬 단면
<ol><li>파라핀에 내장된 상처 블록을 하룻밤 동안 4°C에서 식힙니다.</li>
	<li>마이크로톤 및 오리엔드의 블록 홀더에 파라핀 블록을 삽입하여 블레이드가 블록을 가로질러 곧장 절단됩니다. 조직이 표피와 진피(도3C,D)의동시 단면을 허용하는 90°에서 조직이 "스탠드"되는 등의 블록을 방향을 지정합니다.</li>
	<li>각각 7 μm의 20-30 파라핀 섹션의 2-4 리본을 만듭니다.</li>
	<li>드라이 페인트 브러시와 해부 괴롭히는 바늘을 사용하여 각 리본을 단단한 검은 색 플라스틱 시트와 같은 단단하면서도 조작 가능한 표면으로 전송합니다.</li>
	<li>각 리본의 상단 부분을 면도날로 분리하고 현미경 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>밝은 필드 현미경의 밑에 얼룩지지 않은 단면을 관찰하여 어떤 자가 부상당한 조직을 포함하고 있는지, 이는 모낭의 부재, 결합 조직 또는 표피의 출현 변화 및/또는 딱지의존재(도 4A,B)에의해 확인될 수 있다.</li>
	<li>상처가 시작되기 전에 최대 20개의 단면에 상처가 없는 부분을 버리십시오.</li>
	<li>얼룩이 없는 섹션에서 상처가 발견되지 않을 때까지 7.3 및 7.4 단계를 반복하여 상처를 통해 단면.</li>
</ol>8. 파라핀 섹션 장착
<ol><li>첫 번째리본(그림 3E)부터시작하여 면도날로 5개 섹션마다 별도의 파라핀 섹션이 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 번호와 모든 단면 번호가 있는 현미경 슬라이드라벨.</li>
	<li>젖은 페인트 브러시로 5 개의 섹션의 그룹을 잡고 따뜻한 수조 (40-45 °C)의 물 표면에 띄워 서 평평하게하십시오.</li>
	<li>라벨이 부착된 현미경슬라이드(그림 3F)중 하나를 사용하여 수조에서 5개의 섹션의 그룹을 선택하고 최대 24시간 동안 37°C의 슬라이드 워머 세트에 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드 를 슬라이드 상자에 똑바로 세워 보관합니다.</li>
</ol>9. 조직학적 염색
<ol><li>8th 현미경 슬라이드(매40번째 파라핀 섹션에 해당)를 헤마톡슬린과 에오신을 함유한 염색 랙및 얼룩으로 옮겨보십시오.</li>
</ol>10. 현미경 이미징
<ol><li>4배 의 객관적이고 디지털 획득 기능을 갖춘 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 이미지를 촬영하는 배율을 기록합니다.</li>
	<li>각 스테인드 슬라이드의 상단 부분의 전체 상처를 이미지와 양쪽에 부상되지 않은 조직을 포함해야합니다. 상처가 단일 그림의 프레임보다 크면 여러 겹치는 사진을 찍습니다.</li>
	<li>형태 분석에 대한 단면 번호를 포함하여 파일을 저장합니다. 동일한 상처의 사진을 겹치기 위해 a, b, c 등이 이어지는 단면 번호를 사용합니다.</li>
</ol>11. 형태 분석
참고: 상처가 여러 장의 사진에 걸쳐 있는 경우 개별 사진에서 가져온 측정값을 합하여 스프레드시트에 기록할 상처 섹션당 미터법당 한 값을 얻습니다.
<ol><li>이미지 J에서 염색 된 상처 사진의 디지털 파일을 엽니 다. 분석을 위해 스티치 된 사진을 사용하지 마십시오. 축소된 중복 된 그림에서 측정을 수행하여 분리하고 그림에서 그림으로 측정을 선택할 랜드 마크를 찾아서 측정을 수행합니다.</li>
	<li>스케일 및 측정 기본 설정을 설정합니다.<ol>
<li>분석 에서"설정 규모"를 선택합니다. 픽셀의 거리, 알려진 해당 거리 및 거리 단위(= 길이 단위)로 거리를 입력합니다. 축척이 창에 나타나야 하며 이미지가 획득한 배율에 대응해야 합니다.</li>
		<li>"전역"란을 선택하여 열려 있는 각 이미지에 대해 배율을 동일하게 유지합니다.</li>
		<li>이미지 J가 닫혀 다시 열릴 때마다 11.2.1에서 11.2.2단계를 반복합니다.</li>
		<li>"영역" 아래 "| 확인 측정값을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상처 길이 측정<ol>
<li>피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.</li>
		<li>상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림4A, B)을측정합니다.</li>
		<li>이 두 랜드마크에 도달하기 위해 진피 교차로를 따라 추적합니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 상처의 한쪽에 진피 접합을 따르고, 이동 혀는 과립 조직 또는 과립 조직과 딱지 사이의 접합의 우수한 측면을 따라 계속되는 경우 이동 혀에 도달 한 다음 마지막으로 다른 쪽에 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림 4E,F).</li>
		<li>분석 에서 측정을 클릭합니다. 측정 길이는 스케일에 설정된 것과 동일한 단위로 나타납니다.</li>
		<li>측정을 추적하기 위해 스프레드시트를만듭니다(보조 표 1).</li>
		<li>상처 길이를 스프레드시트에 복사합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>표피 길이 측정<ol>
<li>표피가 전체 상처를 덮는 경우 표피 길이는 상처 길이와 동일합니다.<ol>
<li>"상처 길이" 측정값을 Excel 스프레드시트의 "표피 길이" 컬럼에 복사하고 11.5단계로 건너뜁니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우,"Freehand 선택"을선택하고 과립 조직과 제1 모낭 사이의 과립 조직 또는 딱지 사이의 접합의 우수한 측면에 따라 각 표피 선도 가장자리 사이의 거리를 측정(도 4C,D).<ol>
<li>분석 에서 측정을 클릭합니다.</li>
			<li>이 측정값을 상처 길이에서 빼고 Excel 스프레드시트의 "표피 길이"아래 의 수를 기록합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>상처 부위 측정<ol>
<li>피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.</li>
		<li>상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림4A, B, E, F)을측정합니다.</li>
		<li>표피의 우수한 측면을 따라 추적 (딱지를 포함하지 않음) 또는 상처가 표피에 의해 완전히 덮여있지 않은 경우 과립 조직의 우수한 측면.</li>
		<li>반대 모낭에 도달하면 그리고 지방 조직 이나 근육에 도달 할 때까지 과립 조직으로 모낭을 따라 수직으로 추적 계속. 과립 조직의 열등한 경계를 따라 상처의 반대쪽으로 가서 모낭을 따라 시작지점에 합류하여영역(도 4E,F)을닫는다.</li>
		<li>분석 에서 측정을 클릭합니다.</li>
		<li>상처 부위를 "측정된 상처 영역"아래 스프레드시트에 복사합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>표피 영역 측정<ol>
<li>피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.</li>
		<li>상처가 완전히 상형화된 경우:<ol>
<li>표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 반대 모낭에 도달할 때까지 피피와 진피(도4D)를거쳐 시작점으로 "반환"하여 영역을 완성한다.</li>
			<li>분석 에서 측정을 클릭합니다.</li>
			<li>표피 영역을 "측정된 표피 영역"에서 Excel 스프레드시트에 복사하고 11.7단계로 건너뜁니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>상처가 완전히 상형화되지 않은 경우 :<ol>
<li>표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 앞가장자리까지 추적하고 데르모 표피 접합(도4C)에따라 시작점으로 돌아갑니다.</li>
			<li>분석 에서 측정을 클릭합니다.</li>
			<li>상처의 반대편에 있는 11.6.3.1 및 11.6.3.2단계를 반복한다.</li>
			<li>분석에서 측정값을 클릭합니다.</li>
			<li>11.6.3.2 및 11.6.3.4 단계에서 얻은 두 숫자를 합산하고 스프레드시트에서 "측정된 표피 영역"으로 결과를 입력합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>40단(8번째 슬라이드마다)마다 11.3~11.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>전체 상처의 표피 영역을 계산합니다.<ol>
<li>스프레드시트 "표피 길이"에 새 열을 만듭니다.</li>
		<li>마지막 단을 제외한 각 섹션에 대해 "표피 길이"의 수를 280으로 곱합니다(7 μm 두께 섹션 x 40 단면).</li>
		<li>마지막 단면(단면도의 두께)에 대해 "표피 길이"의 수를 7로 곱합니다.</li>
		<li>각 섹션에 대해 "계산된 표피 영역"의 값을 합하여 전체 상처의 표피 영역을 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상처 전체의 상처 부위를 계산합니다.<ol>
<li>상처 길이 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4 단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전체 상처의 표피 볼륨을 계산합니다.<ol>
<li>"측정된 표피 영역" 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4 단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전체 상처의 상처 볼륨을 계산합니다.<ol>
<li>"측정된 상처 영역" 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>상처의 표피 볼륨 비율을 계산합니다.<ol>
<li>총 표피 볼륨을 총 상처 부피로 나누고 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다(각 섹션에 대해 이 비율을 하지 마십시오).</li>
	</ol></li>
	<li>상처 영역 중 표피 영역의 백분율을 계산합니다.<ol>
<li>총 표피 영역을 총 상처 부위로 나누고 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다. 상처가 완전히 상피되면이 숫자는 100이어야합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

양측 절제 상처 모델은 상처 치유의 많은 다른 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 매우 사용자 정의 절차입니다. 상처 치유 프로젝트를 시작하기 전에 조사관은 특정 효과 크기의 결함을 감지하는 데 필요한 상처 수를 결정하기 위해 전력 분석을 수행해야합니다. 개별 마우스 또는 상처가 생물학적 복제로 사용되어야 하는지에 대한 문헌 내에 불일치가 존재하지만, 최근 연구에 따르면 단일 동물4에대한 두 상처 사이에 는 유의한 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 이것은 단 하나 동물에게서 상처가 서로 독립적이고 결점을 검출하는 데 필요한 마우스의 수를 감소시키는 생물학 복제로 간주될 수 있다는 것을 건의합니다. 이는 중성4에도달하기 위해 많은 수의 상처가 필요한 작은 효과 크기를 고려할 때 관련이 있습니다. 또한, 전력 계산의 결과는 동물 당 2 및 4 개의 상처가 가장 일반적인 각 동물에 수행되는 상처 수에 영향을 미칠 수 있습니다.
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피부 상처 치유는 순차적으로 겹치는 단계를 가진 복잡한 생물학적 과정입니다. 손상된 상피의 장벽 기능을 복원하기 위해 일시적이고 공간적으로 조절되는 세포 및 분자 공정의 조정이 필요합니다. 첫 번째 단계에서염증, 호중구 및 대식세포는 상처로 이동하여 국소 및 전신 방어1을동원합니다. 염증 단계를 따르고 겹치는 것은 증식 단계입니다. 섬유아세포는 급속히 확산되고 과립 조직으로 이동하기 시작합니다. 선두 가장자리에서 멀리 각질세포는 앞가장자리에서 분화된 각질 세포가 상처2를다시 상형화하기 위해 이동함에 따라 상처쪽으로 방향을 내다보며 증식한다. 마지막으로, 리모델링 및 성숙 단계가 시작되며, 그 동안 과립 조직의 섬유아세포는 콜라겐을 합성하고 퇴적시키기 시작합니다. 새 행렬의 리모델링 및 조직은 부상3다음에 최대 1년까지 지속될 수 있습니다. 때문에 다중 세포 모형 사이 교차 이야기와 관련시키는 중복한 사건의 복잡성 때문에, 그리고 수년간의 연구에도 불구하고, 상처 치유의 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 많은 것은 제대로 이해되지 않습니다.
마우스 모델은 사용편의성, 상대적으로 저렴한 비용 및 유전적 매니풀성1,4,5로인한 상처 치유 메커니즘을 조사하기 위한 주요 포유류 모델이다. 다른 유형의 상처가 뮤린 모델에서 설명되었지만, 가장 흔한 상처는 절제적 상처 (양측 펀치 또는 직접 펀치 생검)이며 절개 상처 모델4가뒤따릅니다. 절제상처 모델은 본질적으로 치유 과정을 거치지 않은 대조군 조직을 생성하기 때문에 절개 모델에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 외과 프로토콜의 일부로 절제되는 펀치 생검 조직은 상처입은 조직과 동일한 방식으로 처리될 수 있으며 원하는 기준을 위한 동종 성 조건을 확립하는 데 사용될 수 있다. 절제된 대조군 조직은 또한 피부 전처리의 효과를 평가하거나 부상 시 성공적인 유전자 변경을 확인하는 경우에 유용할 수 있다4.
치유 매개 변수는 평면도 또는 히스토로지를 포함한 다양한 기술에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 평면도는 상처의 가시적 특성만을 평가할 수 있으며, 딱지의 존재로 인해, 종종 히스토로지에 의해 시각화되는 치유의 측정과 상관관계가 없기 때문에, 따라서 히스토로지분석4의"금본위제"를 만든다. 조직학적 분석이 금본위제임에도 불구하고, 상처6,7의임의하위집합에서 가장 자주 수행됩니다. 예를 들어, 상처를 포함시키고 절단하기 전에 상처를 "절반"으로 절단하는 것은 현재 재료 및 데이터 분석에 소요되는 시간과 자원을 줄이는 일반적인 관행입니다. 본 프로토콜에 기재된 형태 분석 방법은 전체 상처 조직을 포괄하고, 상처의 형태학적 특성을 정확하게 반영하고, 작은 효과 크기로 상처 치유 결함을 검출할 가능성을 높이기 위해 개발되었다. 본 프로토콜에서, 우리는 가장 일반적으로 연구된 뮤린 상처, 양측 전체 두께 절제적 상처를 생성하기 위한 수술 방법뿐만 아니라, 조직학적 분석을 위한 상세하고 엄격한 방법을 현장에서 거의 사용되지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>100% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비</td><td>NOVAPLUS</td><td>V9100</td><td>70% 이소프로필 알코올, 멸균</td></tr><tr><td>수산화</td><td></td><td></td><td></td>암모늄</tr><tr><td>생검 패드</td><td>Cellpath</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>검은색 플라스틱 시트</td><td></td><td></td><td>단단하면서도 조작 가능한 것, 종이 한 장 크기 정도의</td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td></td><td></td>, <td>디지털 수집 기능 및 4X 대물렌즈</td></tr><tr><td>포함, 면 팁 애플리케이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립,</td><td></td><td></td><td>22 x 60 #1</td></tr><tr><td>치과용 왁스 시트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td></td><td></td><td>눈금자 포함 해당되는 경우</td></tr><tr><td>해부 티징 바늘 (직선)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>임베딩 몰드</td><td></td><td></td><td>22 x 22 x 12</td></tr><tr><td>임베딩 링</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M460</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이발기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Conair</td><td></td><td>촉촉한 건조 가열 패드</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome Microtome</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>블레이드</td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라핀 유형 6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>퍼마운트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드</td><td>Aplicare</td><td>82-255</td><td></td></tr><tr><td>처리 카세트</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M490-2</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>ASR.009</td><td></td> <td>일반</td></tr><tr><td>의무 메스 블레이드 #10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스 손잡이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 멸균</td><td>날카로운 수술 가위</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피부 생검 펀치</td><td></td><td></td><td>연구원이 결정한 크기</td></tr><tr><td>슬라이드 박스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 워머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrosted microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 037 246</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>티슈 임베딩 스테이션</td><td></td><td></td><td>파라핀 디스펜서와 냉각판 최소</td></tr><tr><td>티슈 프로세서</td><td></td><td></td><td>진공 펌프가 있는 오븐 최소</td></tr><tr><td>트리플 항생제 안과 연고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋,</td><td>수술용 멸균</td>곡선 팁<td></td><td></td></tr><tr>, 수술<td>용 멸균</td><td>테이퍼 팁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WypAll X60</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34865</td><td></td></tr></tbody></table>

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

뮤린 절제 상처 모델은 염증, 증식 및 리모델링 : 상처 치유의 순차적으로 겹치는 각 단계를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 뮤린 상처는 치유 과정의 이러한 다른 단계가 측정 할 수있는 조직학적으로 잘 정의되고 쉽게 인식 할 수있는 상처 침대를 가지고 있습니다. 필드 내에서 조직학적 분석을 위해 임의로 정의된 상처 "중간"을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 상처는 3차원 실체이며 종종 조직학적으로 대칭적이지 않으며, 작은 효과 크기로 형태학적 결함을 검출하기 위해 잘 정의되고 견고한 정량화 방법의 필요성을 뒷받침한다. 이 프로토콜에서는 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 만드는 절차뿐만 아니라 일부 직렬 섹션에서 이미지 처리 프로그램을 사용하여 형태 매개 변수를 측정하는 방법에 대한 자세한 지침을 설명합니다. 상처 길이, 표피 길이, 표피 영역 및 상처 영역의 2차원 측정은 상처, 전체 상처 영역, 표피 부피 및 상처 부피를 포함하는 3 차원 표피 영역을 추정하기 위해 섹션 사이의 알려진 거리와 함께 사용됩니다. 이 상세한 조직학적 분석은 기존의 분석보다 시간과 자원이 더 많이 소비되지만, 그 엄격함은 본질적으로 복잡한 상처 치유 과정에서 새로운 표현형을 검출할 가능성을 증가시킵니다.

도 5는 여러 외과 의사에 의해 다른 마우스 균주에서 생성되고 다른 개인에 의해 분석된 야생형 상처에 대한 형태측정 분석을 수행하여 얻은 측정 및 계산된 값의 범위를 묘사합니다. 다른 균주에서 야생 형 마우스는 우리의 연구와 문학9,10에서모두 설명 된 통계적 차이를 표시 할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과에 기초하여, 우리는 한 연구 내에서 단 하나의 균주에서 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 동일 개별이 특정 연구 결과 내의 모든 상처를 능력을 발휘하는 것이 좋습니다 하더라도, 0일째에 상처의 지역이 개별의 일 사이에서 통계적으로 다르지 않는 한 다중 개별은 군의관으로 행동할 수 있었습니다. 마지막으로, 이 프로토콜에 설명된 형태 분석이 광범위할 수 있기 때문에 여러 개인이 동일한 실험의 일부를 분석할 수 있지만, 두 개의 샘플분석 결과가 서로의 5% 이내인...

이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

이 프로토콜은 조직학적 분석을 사용하여 마우스 절제 상처의 강력한 형태 측정값을 얻습니다. 이 기술을 사용하여 직렬 섹션의 하위 집합을 사용하여 전체 상처를 분석할 수 있으므로 놓칠 수 있는 결함을 보다 정확하게 감지할 수 있습니다. 절차를 보여주는 것은 린지 레아, 내 실험실에서 연구 동료가 될 것입니다.마취 된 성인 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 어깨 수준에서 마우스의 뒷면에 모피를 제거하기 위해 코달 - 로스트랄 운동에 전기 면도기 클리퍼를 사용합니다. 뒷면에서 20도 각도로 유지된 면도날을 로스트랄-소달 운동으로 사용하여 노출된 피부에서 남은 모발을 제거한 다음, 포비단 요오드 1개, 이소프로필 알코올 준비 패드 와이프 1개로 피부를 청소합니다. 상처 유도의 경우 깨끗한 종이 기반 수건을 치과 용 왁스로 덮인 평평한 표면에 드레이프하고 마우스를 수건에 놓습니다.등대 중간선을 따라 견갑골 사이에 마우스의 피부를 꼬집어 몸에서 멀리 끼인 피부를 당깁니다. 마우스를 사이드 거짓말 위치로 전환하면 원하는 상처 크기의 생검 펀치를 가능한 한 신체에 가깝게 배치하고 피부가 이완할 수 있습니다. 흔들기 동작을 사용하여 펀치를 눌러 피부의 모든 층을 뚫고 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 상처에서 펀치 생검을 제거하여 필요에 따라 주변 피부에서 펀치를 풀어주세요.그런 다음 마우스가 모니터링 및 진통제로 복구할 수 있도록 합니다. 상처 침대의 형태 분석의 경우 디지털 염색 된 상처 이미지를 엽니 다. 스케일 및 측정 기본 설정을 설정하려면 분석에서 스케일 설정을 선택하고 픽셀, 알려진 거리 및 길이 단위로 거리를 입력합니다.전역 및 확인을 선택하여 열려 있는 각 이미지에 대해 배율을 동일하게 유지하고 측정 분석 및 설정을 선택하여 영역 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 상처 길이를 측정하려면 프리핸드를 선택하고, 상처한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭부터 다른 쪽의 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭에서 시작하여 진피 표피 접합을 따라 추적할 수 있는 도구를 사용합니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 이동 혀가 끝나는 상처의 한쪽에 진피 표피 접합을 따라 갈과 화조직과 딱지 사이의 접합을 계속하여 혀와 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭에 도달한다.그런 다음 분석 및 측정을 클릭합니다. 측정 길이는 스케일에 설정된 것과 동일한 단위로 나타납니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 과립 조직의 우수한 양상 또는 과립 조직과 첫 번째 모낭에 딱지 사이의 접합에 따라 각 표피 선도 가장자리 사이의 거리를 측정합니다.상처 부위를 측정하기 위해, 프리핸드 도구를 사용하여 상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 다른 쪽의 부상되지 않은 조직의 제1 모낭에서 시작하여 표피또는 과립 조직의 우수한 측면을 추적한다. 과립 조직으로 모낭을 따라 수직으로 추적계속. 반대 모낭과 지방 조직 또는 근육에 도달하면, 상처의 반대편에 과립 조직의 열등한 경계를 따라 영역을 닫기 위해 모낭을 따라 출발점에 합류.상처가 완전히 상피되지 않은 경우, 표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 앞가장자리까지 추적하고 진피 표피 접합에 따라 시작점으로 돌아갑니다. 그림과 같이, 전체 상처 에 걸쳐 2D 측정을 복용할 때, 우리는 현장에서 일반적으로 사용되는 방법인 상처의 중간에 만 2D 분석을 통해 불가능한 파라미터를 계산할 수 있었습니다. 본 실험에서, 상처 부위의 2D 측정은 상처 부위의 전체 상처 또는 중간 부분 집합에 걸쳐 사용되고 평균화되었고 실험 그룹 또는 분석 방법 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.그러나 계산된 상처 부피는 실험군 간에 상당히 달랐으며, 상처 치유 파라미터의 심층 적 조직학적 분석의 중요성을 입증하였다. 조직 학적 분석을 위해 일관되게 크기의 상처를 생성하고 엄격한 직렬 단면을 수행하는 것은 정확한 형태 측정 해석에 중요합니다. 얼룩이 없는 단면은 면역형광 또는 마슨의 삼색 염색을 위해 상처 치유의 다른 측면을 측정하는 데 사용할 수 있으며, 플래시 냉동 상처는 정량적 단백질 분석을 위해 morphometry와 함께 사용될 수 있습니다.

murine-excisional-wound-healing-model-histological-morphometric-wound

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는 상세한 분자 분석을 위해 적절한 시점에서 대장내시경으로 인한 상처 부위를 분리하는 절차를 설명합니다. 이 분석은 위장관의 염증성 상태에서 상처 치유 과정을 이해하는 데 도움이 됩니다.

대장내시경 유도 쥐 상처 모델: 치유 과정을 이해하기 위해 결장에서 생검 유도 상처 침대를 분리하는 방법

생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.

상처 치유의 생쥐 모델

포유류가 발달하는 동안, 임신 초기의 피부 상처는 흉터 없이 아물다. 여기에서는 E16.5(흉터가 없는) 및 E18.5(흉터가 있는) 마우스 배아의 피부 등쪽에서 흉터가 없는 태아의 상처 치유에 대한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델에 대해 자세히 설명합니다.

흉터 상처 수리의 마우스 태아의 피부 모델

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

이 연구의 목적은 화상 상처 치유의 뮤린 모델을 개발하는 것이었습니다. 예열된 황동 템플릿을 사용하여 마우스의 등불 피부에 열 화상이 유도되었다. 연소된 조직은 유전적으로 유사한 기증자 마우스의 꼬리에서 수확한 피부 이식으로 파괴되고 겹쳐졌습니다.

동종 유전자 이식편으로 재구성된 화상 상처의 뮤린 모델

여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

이 연구는 두 가지 중요한 실험 기법을 제시합니다: 상처 봉합을 평가하기 위한 쥐 상처 모델의 구축과 세포 생존력을 보존하기 위해 쥐 피부에서 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

마우스 상처 모델 및 단일 세포 현탁액 준비

상처는 전 세계적인 보건 문제를 나타냅니다. 이 연구는 상처 측정 변동성을 최소화하기 위해 디지털 플레니메트리를 활용한 표준화된 사진 부스를 개발했습니다. 14일 동안 생쥐의 상처를 모니터링한 결과, 처음에는 상처 부위와 둘레가 증가한 후 점차 봉합되는 것으로 나타났습니다. 이 방법론은 전임상 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스 모델에서 상처 봉합 동역학을 평가하기 위한 디지털 플레니메트리

치유 과정의 다양한 단계에서 생리학적 또는 병리학적 조건에서 다양한 치료제를 평가할 수 있는 쥐 피부 상처 모델이 기술되었습니다. 또한, 조직 복구 기간 동안 상처 수축 속도를 모니터링하기 위한 수동 평면측정 프로토콜도 상세히 안내되어 있습니다.

쥐 수술 피부 상처 모델: 상처 치유 연구 및 생체재료 평가를 위한 접근법

학습하세요 생쥐 양측 전층 절제 상처 유도 및 조직학적 형태 분석 방법을. 연속 절편을 활용한 정량적 측정으로 치유 결함을 정확히 검출하여 피부 재생 메커니즘 연구에 활용합니다.

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

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