Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

Il metodo qui descritto per isolare il liquido prossimale sia nell'uomo che nei topi, può essere applicato per studiare il microambiente del cancro del pancreas per identificare nuovi biomarcatori di malattia. Utilizzando questo semplice protocollo, è possibile tradurre i risultati clinici dal succo pancreatico a modelli murini di PDAC per eseguire studi meccanicistici. Il succo pancreatico è un fluido corporeo in gran parte inesplorato che si è dimostrato promettente come fonte di preziosi biomarcatori per aiutare la diagnosi preoperatoria e la profilazione del paziente.

Io mostrerò la prima parte del protocollo, e Marialuisa Barbagallo, una postdoc del nostro laboratorio, dimostrerà la seconda parte del protocollo. Stimare la posizione del dotto pancreatico utilizzando le misurazioni acquisite durante l'imaging. Quindi palpare la superficie anteriore del pancreas per identificare la sua posizione precisa.

Tenere la testa pancreatica nel duodeno dal basso ed elevarla con la mano sinistra, segnando la posizione del dotto pancreatico con il primo dito. Usa la mano destra per inserire una siringa da tre millilitri con un ago calibro 25 nel pancreas, appena distalmente al pollice sinistro. Decidere la profondità di penetrazione e il grado di inclinazione dell'ago in base alle misurazioni preoperatorie e alla percezione di essere penetrati nella parete del condotto.

Prelevare il succo con la siringa. Se non è possibile recuperare il succo, riposizionare l'ago nel tentativo di incannulare il dotto pancreatico. Una volta recuperato il succo pancreatico, spostarlo al di fuori del campo sterile e trasferirlo in una provetta sottovuoto EDTA da tre millilitri.

Mantenere la provetta a quattro gradi Celsius fino a quando il campione non viene trasferito in laboratorio. Per elaborare il succo pancreatico, centrifugarlo a 400 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere eventuali cellule o detriti. Recuperare il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.

Per isolare il liquido interstiziale tumorale o TIF, mediante centrifugazione, tagliare il tumore a metà, sciacquare le due parti in PBS e tamponarle delicatamente su carta da filtro, muovendosi il più velocemente possibile per evitare l'evaporazione dal tumore. Trasferire immediatamente il tumore in un colino cellulare di nylon da 20 micrometri, fissato su una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 400 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Recuperare il TIF dal fondo del tubo, quindi aliquotarlo e congelarlo immediatamente su ghiaccio secco. Conservare a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Per isolare il TIF utilizzando l'eluizione, tagliare il tumore in piccoli pezzi con le forbici o un bisturi e sciacquarli accuratamente con PBS freddo.

Trasferire i pezzi di tumore in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 500 microlitri di PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione degli analiti. Incubare il tessuto per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri ed eseguire una serie di fasi di centrifugazione a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali cellule dal campione.

Recuperare il surnatante dopo ogni centrifugazione e trasferirlo in una nuova provetta. Dopo l'ultima centrifugazione, aliquotare immediatamente e congelare il campione TIF su ghiaccio secco. Conservalo a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.

Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere il succo pancreatico da pazienti con PDAC e altre afflizioni pancreatiche benigne. Dopo aver filtrato gli ampi segnali NMR delle macromolecole, i segnali provenienti da metaboliti a basso peso molecolare erano evidenti. L'analisi OPLS-DA supervisionata ha mostrato che il profilo metabolico nel succo pancreatico era in grado di discriminare tra pazienti PDAC e non PDAC con un'accuratezza dell'82,4% È interessante notare che l'analisi metabolomica eseguita su campioni di plasma degli stessi pazienti non ha prodotto lo stesso potere discriminante.

Per dimostrare che il contenuto di liquido interstiziale tumorale riflette in modo affidabile i cambiamenti nel microambiente tumorale, due linee cellulari di cancro al pancreas con velocità glicolitiche opposte sono state iniettate per via sottocutanea nei topi. Dopo l'asportazione dei tumori, sono state quantificate le concentrazioni di glucosio e lattato. Il liquido interstiziale tumorale proveniente da tumori altamente glicolitici conteneva meno glucosio e più lattato rispetto ai tumori a basso glicolitico.

In questo studio, abbiamo eseguito l'analisi metabolomica. Tuttavia, questi fluidi prossimali sono adatti per molte altre applicazioni a valle, come la spettrometria di massa e la profilazione dei microRNA.