في فحص Vivo CRISPR/Cas9 لتقييم وظيفة الجينات في وقت واحد في جلد الماوس وتجويف الفم

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للباحثين بالتحقيق في نفس الوقت في الوظائف المثبطة للورم لمئات الجينات في سرطان الرأس والرقبة بجزء بسيط من تكلفة نموذج الفأر بالضربة القاضية التقليدي. هذه التقنية مرنة ويمكن تكييفها لتغطية التعبير عن الجينات لدراسة وظيفتها في الجلد. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول مكتبة كريسبر المستهدف على أنواع السرطان الأخرى.

ضع الجانب البطني للحيوان المخدر لأعلى في مرحلة الجراحة الساخنة واستخدم شريطا جراحيا لتثبيت الكفوف في مكانها. ضع أنبوب التخدير المخروطي للحصول على إمداد مستمر بالأيزوفلوران والأكسجين حتى تكتمل الجراحة. لتأكيد الحمل E9.5 ، ضعي كمية صغيرة من كريم إزالة الشعر على البطن ووزعيه على مساحة ثلاثة × ثلاثة سنتيمترات مربعة باستخدام قضيب قطني.

بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، قم بإزالة الكريم برفق بشاش أو منديل وامسح المنطقة نظيفة باستخدام PBS و 70٪ إيثانول. باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية والهلام ، افحص الفأر الحامل بحثا عن اليوم الجنيني E9.5. يمكن القيام بذلك أيضا في اليوم السابق في E8.5 لتوفير الوقت في يوم الجراحة.

قم بإزالة جل الموجات فوق الصوتية وامسح المنطقة نظيفة باستخدام BPS ثم 70٪ إيثانول. حقن أكثر من مسكن تحت الجلد. ثم تقوم بتعقيم الملقط والمقص لعمل شق عمودي في الجلد.

استخدم ملقطا غير حاد لفصل الجلد حول الشق عن الصفاق. ثم تقوم بتعقيم الملقط والمقص لقطع الصفاق. باستخدام ملقط حاد ، اسحب قرن الرحم الأيمن والأيسر برفق وعد الأجنة.

أعد إدخال معظم قرون الرحم ، لكن اترك الطرف البعيد لقرن الرحم الذي يحتوي على ثلاثة أجنة مكشوفا. باستخدام ملقط حاد ، ادفع الرحم واسحبه برفق مع الأجنة الثلاثة ، من خلال الفتحة الموجودة في غشاء السيليكون لطبق بتري المعدل. قم بتثبيت طبق بتري باستخدام مكعبات من طين النمذجة.

ثبت الرحم مع الأجنة الثلاثة داخل طبق بتري ، باستخدام قالب سيليكون. ثم قم بتسطيح سدادة السيليكون على جانب الأجنة باستخدام أداة حادة. املأ طبق بتري ب PBS معقم واغسل غشاء السيليكون في قاع طبق بتري ، ببطن السد الحامل ، وبالتالي منع أي تسرب.

حرك رأس الموجات فوق الصوتية إلى طبق بتري ، على ارتفاع 0.5 سم تقريبا فوق الجنين العلوي واضبط المرحلة بحيث يصبح التجويف الأمنيوسي مرئيا بوضوح في عرض الموجات فوق الصوتية. قم بمحاذاة إبرة الحاقن بعناية في طبق بتري المعدل. باستخدام المعالج الدقيق ، ضع طرف الإبرة في حدود خمسة ملليمترات من الجنين العلوي ، ثم قم بتبديل الإبرة ذهابا وإيابا للانتقال إلى المستوى حيث يظهر طرفها الأكثر سطوعا في صورة الموجات فوق الصوتية.

باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، ادفع الإبرة عبر جدار الرحم إلى التجويف الأمنيوسي. حقن 62 نانولترا من الفيروس العدسي بمكتبة sgRNA بسرعة حقن بطيئة. اضغط على زر الحقن ثماني مرات ليصبح المجموع 496 نانولترا لكل جنين.

كرر نفس الإجراء مع الجنينين الآخرين. ثم ارفع رأس الموجات فوق الصوتية وقم بإزالة سدادة السيليكون. دفع أول اثنين من الأجنة الثلاثة برفق إلى بطن الفأر باستخدام قطعة قطن معقمة.

اسحب الأجنة الثلاثة التالية وادفع الجنين الثالث الذي تم حقنه مسبقا. كرر إجراء الحقن حتى يتم حقن العدد المطلوب من الأجنة ، مع التأكد من عدم تجاوز 30 دقيقة من التخدير. عند الانتهاء ، ارفع رأس الموجات فوق الصوتية ، وقم بإزالة المعالج الدقيق بالإبرة ، وشفط PBS وإزالة طبق بتري.

باستخدام مناديل معقمة ، امتصاص أي PBS قد يكون قد تراكم في تجويف البطن. أغلق الشق البريتوني باستخدام خيوط قابلة للامتصاص. ثم استخدم دبابيسين لإغلاق الشق في جلد البطن.

بعد ذلك ، يجب أن تظهر قراءات تسلسل الجيل للحمض النووي المضخم PCR من الخلايا المنقولة في مكتبة البلازميد والفيروسات العدسية ارتباطا عاليا. إذا كانت قراءات sgRNA من الحمض النووي البلازميد لا تظهر تمثيلا متساويا ل sgRNAs ، فيجب تكرار إجراء تحضير الفيروس وتركيزه بعناية. تظهر هنا نتائج الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لفيروس العدسات الذي يحمل Cre recombinase في صغار الفأر E9.5 Lox-STOP-Lox في يوم ما بعد الولادة P0.

في حين أن العيار العالي للفيروس سيؤدي إلى تغطية أكبر لجلد الفأر ، إلا أنه سيؤدي أيضا إلى نقل العديد من الحمض النووي الريبي إلى نفس الخلية. تظهر هذه المؤامرة قراءات تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي المضخم بتفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الخلايا المنقولة في مكتبة البلازميد والفيروسات العدسية ، بالإضافة إلى قراءات من أربعة أورام تمثيلية. يتم إثراء أدلة sgRNA التي تستهدف مثبطات الورم ADAM10 و RIPK4 في عينات الورم مقارنة بتجمع البلازميد أو الخلايا المصابة.

يعد إجراء الجراحة في E9.5 أمرا بالغ الأهمية. تذكر التحقق من الحمل بالموجات فوق الصوتية ، بعد تسعة أيام من إعداد الصليب وتحديد النقطة الزمنية الجنينية في كل أنثى فأر. بمجرد ولادة الجراء ، يمكن عزل الخلايا المنقولة وتحديدها على نطاق واسع باستخدام أحدث تقنيات التنميط الجيني مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.