Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

Este protocolo es el primero en implementar CESI-MS para la caracterización no solo de la proteína corona, sino también de la corona de metabolitos de nanomateriales. CESI ofrece una separación ortogonal a los métodos tradicionales de LCMS, que es altamente reproducible y sensible mientras utiliza solo unos pocos nanolitros de muestra. Para empezar, divida dos mililitros del plasma humano en alícuotas de un mililitro, una para el metabolito y la proteína corona, y otra para la caracterización del metaboloma plasmático.

Incubar un miligramo por mililitro de nanomateriales en el plasma humano durante una hora a 37 grados centígrados mientras se mezcla suavemente a 500 rotaciones por minuto en un termomezclador. A continuación, granular los nanomateriales centrifugando a 4.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante de plasma para el análisis de la corona de metabolitos y conserve el complejo de corona de proteínas del nanomaterial para la caracterización de la corona de proteínas.

Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón PBS 10X y haga vórtice vigorosamente durante dos minutos para eliminar las proteínas no unidas. Centrifugar la solución a 4.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para granular los nanomateriales, luego retire el sobrenadante con cuidado sin alterar la bolita. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón ABC y haga un vórtice vigoroso durante dos minutos para eliminar las proteínas y las sales no unidas.

Repita el paso de centrifugación y deseche el sobrenadante. Disuelva el pellet en 20 microlitros de tampón ABC que contenga 10 milimolares de ditiotreitol para reducir los enlaces disulfuro de proteínas. Incubar la solución durante 30 minutos a 56 grados centígrados.

Agregue dos microgramos de tripsina de grado de secuenciación a los 20 microlitros de tampón ABC que contiene 0,1% de surfactante e incube la solución de digestión a 37 grados Celsius durante 16 horas. Alquilar la muestra añadiendo 20 microlitros de yodoacetamida de 55 milimolares en ABC de 100 milimolares e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Añadir 20 microlitros de ácido clorhídrico 0,1 molar para escindir el tensioactivo y dejar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Enriquezca y desale los péptidos utilizando una punta de pipeta desalinizante empaquetada con C18 como se describe en el manuscrito del texto. A continuación, liofilizar la muestra y almacenarla a 20 grados centígrados negativos hasta el análisis. Tome el plasma de control y el sobrenadante de la incubación de plasma de nanomateriales y póngalos en hielo.

Alícuota 50 microlitros de cada muestra en viales separados, y diluir diez veces con agua destilada. Después del vórtice, mueva 50 microlitros de esta muestra diluida a nuevos viales. Agregue 200 microlitros de cloroformo, 250 microlitros de metanol y 350 microlitros de agua destilada y vórtice vigorosamente durante dos minutos.

Centrifugar a 20, 800 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Tome 500 microlitros del sobrenadante y fíltrelo a través de un filtro centrífugo de tres kilodalton durante dos horas a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Secar 430 microlitros del ultra filtrado en una aspiradora rápida y congelar la muestra.

Antes de instalar los capilares en el instrumento CESI, compruebe que los extremos de entrada y salida de los capilares estén intactos y que no haya roturas visibles en el capilar. A continuación, coloque un nuevo capilar codificado en neutro en el instrumento, siguiendo las directrices del fabricante. Enjuague el capilar de separación en la dirección de avance con ácido clorhídrico 100 milimolar, luego con BGE y finalmente con agua destilada, utilizando las condiciones descritas en el manuscrito de texto.

A continuación, enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE, seguido de agua destilada, ácido clorhídrico 100 milimolares, agua destilada de nuevo y, finalmente, con BGE. Acople CESI al MS utilizando la fuente de nano pulverización y el adaptador. Para el análisis de corona de proteínas, vuelva a suspender las muestras liofilizadas en 20 microlitros de acetato de amonio de 50 milimolares a pH cuatro.

Realizar el análisis CESI-MS para las muestras tal como se describen en el manuscrito del texto. Recopile datos de espectros de masas entre 250 y 2.000 m/z, con adquisición de fragmentación dependiente de los 10 datos principales, y enjuague el capilar entre muestras. Coloque un nuevo capilar de sílice fundida desnudo en el instrumento CESI.

Enjuague el capilar de separación en la dirección de avance con metanol al 100 %, luego enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE para garantizar la formación de gotas en los extremos de salida. A continuación, enjuague el capilar con agua destilada, seguido de hidróxido de sodio 0,1 molar, agua destilada de nuevo y, por último, con BGE. Acople CESI al SEMS utilizando la fuente de nano pulverización y el adaptador.

Para realizar el análisis de corona de metabolitos, vuelva a suspender las muestras de plasma del nanomaterial expuestas y no expuestas en 430 microlitros de agua destilada y vórtice vigorosamente durante dos minutos. Filtre las muestras a través de un filtro de membrana de 0,1 micrómetros. Agregue cinco microlitros de los patrones internos, como se menciona en el manuscrito del texto, a 95 microlitros del filtrado y el vórtice vigorosamente.

Centrífuga a 16, 100 veces G y cuatro grados centígrados. Realizar el análisis CESI-MS para las muestras tal como se describen en el manuscrito del texto. El uso de CESI-MS para la separación y detección proteómica y metabolómica demuestra buenas ventanas de separación en ambos capilares para cada enfoque, lo que permite una caracterización completa de la corona biomolecular.

El método proteómico CESI-MS es capaz de distinguir entre una matriz de proteínas y concentraciones de proteínas en la corona en una amplia gama de composiciones de nanomateriales, y puede distinguir una corona de proteínas única para cada nanomaterial. Este enfoque metabolómico de CESI-MS permite un análisis cuantitativo del metabolito corona y se puede utilizar para descubrir sus huellas dactilares únicas. Aunque este enfoque caracteriza de forma pasiva la corona del metabolito del nanomaterial, sigue siendo capaz de descubrir información interesante sobre el papel de los metabolitos en la corona biomolecular, como la absorción diferencial de isómeros.

Esta técnica permite caracterizar tanto la proteína como el metabolito corona, lo que permite una mejor comprensión de cómo la corona biomolecular completa afecta la absorción de nanomaterial por parte de las células.