Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

Ce protocole décrit une méthode de revêtement pour limiter la croissance des cellules endothéliales à une région spécifique d’une plaque de 6 puits pour une application de contrainte pure en utilisant le modèle de shaker orbital. Une façon courante d’étudier les effets de l’écoulement sur l’endothélium est de faire la culture de cellules endothéliales dans des plaques de culture multi-puits sur un agitateur orbital. Le shaker orbital induit une onde qui tourne autour du puits.

Les cellules au centre du puits connaissent le type de flux qui sont censés conduire à l’athérosclérose. Les cellules plus proches du bord font l’expérience d’un flux que l’on pense protecteur. Les propriétés des cellules dans chaque région sont supposées dépendre des contraintes pures qu’elles subissent.

Cependant, il y a un plancher potentiel dans cette logique. Les cellules endothéliales libèrent des médiateurs d’une mode dépendante de l’écoulement. Ces médiateurs atteindront une concentration uniforme dans le milieu tourbillonnant et affecteront donc les cellules dans des régions autres que celle où elles ont été libérées.

Cela peut corrompre ou masquer les vrais effets du cisaillement sur le comportement des cellules. L’effet ne se limite pas au système de puits tourbillonnant. Cela peut se produire même dans des modèles simples, comme la chambre d’écoulement de plaque parallèle.

Il peut être évité en cultivant des cellules dans une seule partie du système. Ici, nous décrivons les méthodes permettant l’adhésion cellulaire uniquement au centre ou seulement au bord du puits tourbillonnant. Fabrication d’un module en acier inoxydable.

Fabriquer le module en acier inoxydable à partir d’un acier inoxydable de nuance 316 selon un dessin technique fourni. Impression 3D sur des PDP. Préparez un modèle CAO 3D de mouleS PDM à l’aide de SOLIDWORKS conformément à la mise en plan technique fournie.

Exportez le modèle CAO vers un fichier STL et importez le fichier STL dans Cura 2.6.2. Découpez le modèle en calques avec une vitesse d’impression de 50 millimètres par seconde et une densité de remplissage de 60%Exportez le fichier en tant que GCode. Chargez-le sur une imprimante 3D Ultimaker pour l’impression - effectué.

Utilisez l’acide polylactique comme matériau d’impression. Coulée de l’anneau PDMS. Mélangez bien la base PDMS et l’agent de durcissement avec le rapport de 90,9% base et 9,1% agent de durcissement.

Versez la solution bien mélangée dans le moule imprimé en 3D. Retirez les bulles dans une chambre de dégazage sous vide. Durcir pendant une heure dans un four à 80 degrés.

Laissez l’anneau PDMS refroidir à la température ambiante. Retirez ensuite soigneusement l’anneau PDMS durci du moule. Préparation de 1%Pluronic F-127.

Peser cinq grammes de Pluronic F-127. Versez-le dans une bouteille en verre. Ajoutez ensuite une centaine de mil d’eau Milli-Q dans la bouteille en verre.

Cela donne une solution pluronique F-127 à 5%. Assurez-vous que toute la poudre de Pluronic F-127 est immergée dans l’eau. Fermez le capuchon et autoclavez-le à l’aide d’un programme de cycle de stérilisation liquide.

Laissez la solution refroidir à température ambiante avant utilisation. Ajouter 10 mil de solution pluronique F-127 à 5% à 40 mil d’eau Milli-Q autoclavée pour faire une solution de F-127 pluronique à 1%. Effectuez la dilution dans une hotte d’armoire de biosécurité.

Conservez à la fois 1% et 5% Pluronic F-127 à température ambiante. Revêtement de plaque de 6 puits. Module en acier inoxydable autoclave, bague PDMS et pince à épiler avant utilisation.

Effectuer toutes les procédures suivantes dans une hotte BSC et observer les techniques aseptiques pour assurer la stérilité. Placez l’anneau PDMS dans un 6-well à l’aide d’une pince à épiler. Utilisez le bord externe de l’anneau PDMS pour aligner l’anneau PDMS concentriquement dans le puits.

Notez que seules les plaques de puits non traitées par culture tissulaire doivent être utilisées. Placez le module en acier inoxydable sur le dessus de l’anneau PDMS à l’aide d’une pince à épiler. Insérez les extrémités de la pince interne de l’anneau de retenue dans les cales de poignée de l’anneau de retenue.

Pressez le support pour réduire le diamètre de l’anneau de retenue. Mettez-le dans le 6-well, appuyez-le fermement sur le module en acier inoxydable et relâchez les pinces pour fixer l’anneau PDMS dans le puits. Ajouter un mil de cinq microgrammes par fibronectine microlitre au centre ou au bord du puits, selon la région d’intérêt, par l’ouverture de l’anneau PDMS et du module en acier inoxydable.

Faire pivoter la plaque pour vous assurer que la solution de fibronectine couvre toute la région d’intérêt. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés dans un incubateur humidifié sous 95% d’air et 5% de CO2. Retirez la solution de fibronectine du puits.

Et maintenant laver deux fois avec PBS. Une fois cela fait, retirez complètement le PBS du puits. Retirez l’anneau de retenue, le module en acier inoxydable et l’anneau PDMS du puits.

Ajouter 1,5 mil de 1% Pluronic F-127 dans le puits et incuber pendant une heure à température ambiante pour passiver la surface non revêtue. Retirez la solution Pluronic F-127 du puits et lavez trois fois avec du PBS. Une fois lavé, utilisez le puits enduit immédiatement ou conservez à quatre degrés jusqu’à deux semaines avec la couche de PBS dans le puits enduit.

Ensemencement de cellules endothéliales. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez 180 000 cellules dans une plaque de 6 puits enrobée dans 1,5 mil de milieu de culture cellulaire préchauffé. Agiter latéralement la plaque du puits pour s’assurer que les cellules se répartissent uniformément dans le puits.

Laissez-le dans un incubateur humidifié à 37 degrés sous 95% d’air et 5% de CO2 pendant la nuit. Application de contrainte de cisaillement à l’aide d’un agitateur orbital. Les cellules devraient atteindre la confluence après trois jours de croissance.

Remplacez le milieu par 1,9 mil de milieu de culture cellulaire pré-avertissant pour atteindre une hauteur de deux millimètres. Placez une plaque de puits sur la plate-forme d’un agitateur orbital dans un incubateur humidifié et faites-la tourbillonner à 150 tr / min pendant trois jours. Facultatif, après deux jours de cisaillement, des cytokines peuvent être ajoutées au milieu de culture cellulaire pour étudier l’interaction entre les cytokines et le stress pur.

Après le traitement, caillez les cellules pour un autre jour. Dans cette étude, le TNF-alpha a été employé pour activer les cellules. Effectuer une analyse après trois jours d’application de contrainte de cisaillement.

Les images de microscope montrent que Pluronic F-127 a empêché l’adhérence de HUVEC à la région sans revêtement de fibronectin. Aucun HUVECs n’a été fixé à la partie de la surface de puits qui n’avait pas été prétraitée avec de la fibronectine avant la passivation de Pluronic F-127 après 24 heures, dans la figure A, et 72 heures, dans la figure C, de croissance. Sans passivation pluronique F-127, les HUVECs ont été fixés à la surface sans fibronectine, 24 heures après l’ensemencement, dans la figure B, et sont proliférés plus loin de 72 heures, dans la figure D.La barre d’échelle est égale à 500 micromètres.

La tache rouge nucléaire montre la morphologie des HUVECs caillelés, A, au centre, et B, au bord d’un puits complet. La barre d’échelle est égale à une centaine de micromètres. A et B montrent également des contours de cellules tracés par immunostaining de ZO-1.

Notez l’alignement et l’allongement des cellules sur le bord mais pas au centre. Il ne montre aucune différence significative dans l’indice de forme nucléaire, indiquant la rondeur, entre HUVECs cultivés en plein puits et les puits segmentés ont été vus pour HUVECs non traités ou TNF-alpha-traités. Les cellules étaient plus allongées près du bord du puits.

Une tendance pour un plus grand élongation dans HUVECs TNF-alpha-traité n’était pas uniformément significative à travers des endroits. On n’a observé aucune différence significative entre les puits pleins et segmentés dans le nombre de densité d’A, non traité, et de B, HUVECs TNF-alpha-traité à différents endroits radiaux. Dans les deux cas, il y avait plus de cellules par unité de surface au bord qu’au centre du puits.

En conclusion, la méthode que nous avons décrite ici vous permet de cultiver des cellules dans une seule région du puits tourbillonnant ou même, de tout système de culture cellulaire à base de plastique. Cela signifie que les cellules d’une partie du puits connaissant un type d’écoulement ne sont pas influencées par des médiateurs libérés par les cellules d’une autre région connaissant des écoulements différents. Non seulement cela, nous pouvons regarder les cellules cultivées dans une région avec ou sans cellules cultivées dans d’autres régions.

Cela permet de démontrer les effets de ces médiateurs solubles. Tester les effets du milieu conditionné sur les cellules naïves permet la même chose. En analysant le milieu de condition, les médiateurs peuvent être identifiés.