Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

La mutagénesis dirigida se ha adaptado a los flebótomos solo recientemente y es una técnica crucial para comprender el papel y la función de los genes de interés en estos insectos vectores. La microinyección de embriones es un paso muy importante en la edición del genoma de los insectos, pero debe adaptarse a las especies con las que se trabaja, en nuestro caso, los flebótomos. En comparación con las otras especies de insectos, los embriones de flebótomo son muy pequeños.

Tardan mucho tiempo en desarrollarse y son especialmente sensibles al nivel de humedad. Cinco días antes de la inyección, la sangre alimenta a las hembras de flebótomos como para el mantenimiento rutinario de la colonia. Un día después de la alimentación, capture a las hembras alimentadas con sangre en vainas de yeso con un puerto lateral en grupos de 100 a 150 y alimente a las moscas con una solución de sacarosa al 30%.

En el quinto día después de la alimentación con sangre, coloque un trozo blanco de papel de filtro húmedo en la cámara de puesta de huevos. Y use un aspirador bucal para recolectar y transferir alrededor de 10 hembras de la vaina de yeso a la cámara de puesta de huevos. Después de 30 a 60 minutos, retire la placa de Petri y el papel de filtro de la cámara de huevos.

Cuidando que el papel de filtro permanezca húmedo y continúe recogiendo nuevos grupos de hembras y embriones a lo largo de este período. Cuando se hayan recolectado todos los embriones, use un microscopio estereoscópico y un pincel muy fino para transferir cuidadosamente unos 50 embriones a pedazos individuales de papel de filtro negro húmedo, colóquelos en portaobjetos de microscopio, cubiertos con un solo cubreobjetos por portaobjetos. Agregue suficiente agua a cada papel de filtro para mantener los embriones húmedos sin que floten o sean succionados debajo de los cubreobjetos y alinee los embriones contra los cubreobjetos.

Dos o tres horas después del inicio de la recolección de huevos, coloque un portaobjetos bajo un microscopio de disección y use el pincel para agregar agua con cuidado en la parte posterior del papel de filtro. Vuelva a cargar de 0.5 a un microlitros de mezcla de inyección de carga en una aguja de microinyección y monte la aguja en un controlador de inyección neumática, ajustado a 30 libras por pulgada cuadrada de presión bajo el microscopio. Presione el gatillo para expulsar el aire de la punta de la aguja.

Cuando se haya liberado el aire, aumente lentamente la presión de retención. Cuando el material de inyección comience a fluir, disminuya la presión de retención hasta que esté justo por debajo del punto de la mezcla de inyección que fluye de la aguja e inserte la aguja en el costado del primer embrión. Usando el cubreobjetos detrás del embrión como tope trasero, administre una pequeña cantidad de mezcla inyectable en el embrión antes de retirar suavemente la aguja.

Inmediatamente después de retirar la aguja, presione el inyector para eliminar cualquier material relleno de la punta de la aguja y proceda al siguiente embrión. Cuando se hayan inyectado todos los embriones, cuente el número de embriones inyectados para llevar la cuenta y agregue agua al papel de filtro para que el cubreobjetos flote. A continuación, utilice una sonda para sujetar el papel de filtro en su lugar mientras retira el cubreobjetos de los embriones.

Y colocó papel de filtro para secar el exceso de agua del tobogán. Transfiera el papel de filtro a una pila de papel de filtro húmedo en una nueva placa de Petri y transfiera manualmente cada embrión a vainas de yeso humedecidas de tamaño pequeño sin aglomerarse. Luego cubra las cápsulas con una pantalla y almacene las cápsulas en una incubadora de 26 grados con una humedad del 70%.

Al igual que con la mayoría de los protocolos de microinyección exitosos, es importante una buena aguja de microinyección adecuada para los embriones que se inyectan. Las agujas bien afiladas pueden penetrar fácilmente en el embrión sin permitir que el material se escape después de la inyección. Las agujas tiradas no deben tener un cono demasiado largo.

De lo contrario, el lumen de la aguja se vuelve muy estrecho para una parte importante del cono, lo que dificulta que la presión de inyección sea lo suficientemente alta como para forzar el material a través de la aguja. Los embriones criados después de la inyección que estén sanos deben conservarse, mientras que los embriones dañados contaminados, disecados o deformes por hongos deben desecharse. Los alelos mutantes potenciales se pueden identificar en individuos criados después de la inyección mediante análisis de PCR de la región que rodea los sitios de corte esperados.

Tras el establecimiento de la línea mutante utilizando los embriones inyectados, la PCR de genotipado permite la identificación de cruces homocigotos de hermanos mutantes. Es fundamental contar con una buena aguja para ser suave y manipular e inyectar los embriones. Y para asegurarse de que los embriones están hidratados durante todo el procedimiento.

La edición del genoma en algunas moscas apenas comienza. Esta técnica es realmente un primer paso que debería ser seguido por estrategias de modificación del genoma más complejas.