Name: Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin karınca embriyolarına CRISPR aracılı mutagenez için mikroenjeksiyon yöntemini. Harpegnathos saltator'da genetik modifikasyonla iletişim ve davranış genlerinin işlevini sosyal bağlamda inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Danny Reinberg ve Claude Desplan'ın New York Üniversitesi'ndeki laboratuvarlarına ve Jürgen Liebig'in Arizona Eyalet Üniversitesi'ndeki laboratuvarına karınca genetiği konusundaki destekleri için teşekkür ediyor. Hua Yan, Ulusal Bilim Vakfı I / UCRC'den, IIP-1821914 Hibe No. IIP-1821914 kapsamında Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi'nden ve endüstri ortaklarından destek aldığını kabul ediyor. Maya Saar, Amerika Birleşik Devletleri - İsrail İki Uluslu Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu, Vaadia-BARD Doktora Sonrası Burs No. FI-595-19 tarafından desteklendi.

1. Harpegnathos tuzlayıcı kolonilerinin düzenli bakımı
<ol><li>H. saltator'un vahşi tip kolonilerini, 22-25 ° C'de bir karınca yetiştirme odasında şeffaf plastik kutularda ve 12 saatlik bir ışık fotoperiyodunda tutun: 12 saat karanlık (12L: 12D) aydınlatma programı.<ol><li>Bireysel işçileri veya küçük kolonileri desteklemek için küçük kutular (9,5 x 9,5cm2) kullanın. Daha büyük kolonileri desteklemek için orta boy kutular (19 x 13,5cm2) veya büyük kutular (27 x 19 cm 2) kullanın (Şekil 1).</li>
		<li>Yuva kutuları oluşturmak için, kutular için zemin yapmak üzere sıva kullanın. Islak sıva ortamda ve büyük kutularda kuruduğundan, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemek için sıvaya birkaç santimetre derinliğinde ve kutunun arkasından birkaç santimetre uzakta bir köpük blok bastırın. Sıva kuruduktan sonra, belirlenen yuva bölgesini kare bir cam parçası ile örtün. NOT: Küçük kutularda, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemeye gerek yoktur. Karıncalar belirlenen alt yuva bölgesini kullanmayı ihmal ediyorlarsa, camın kare bir kırmızı selofan parçası ile kaplanmasına yardımcı olabilir. Bu, H. saltator'un vahşi doğada kullandığı yuvalara benzeyen karanlık bir yeraltı alanı izlenimi verir ve yavrularını belirlenen bölgeye taşımaya teşvik edebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolonileri haftada iki kez canlı cırcır böcekleriyle besleyin. NOT: Koloniler, bir sonraki beslenmelerinden önce tüm cırcır böceklerini tüketecek kadar beslenmelidir. İzole edilmiş karıncaları ve mutant karınca kolonilerini, her hafta 2-3 kez düzenli bir koloninin işçileri tarafından önceden sokulmuş cırcır böcekleriyle besleyin.</li>
	<li>Bir yıkama şişesi kullanarak alçı yuva kutusu döşemesine düzenli olarak su uygulayın. NOT: Sıva, dokunuşa tozlu gelmeyecek kadar nemli olmalı, ancak eklenen tüm suyun sıva tarafından emileceği kadar kuru olmalıdır. Yuvaların aşırı sulanmaması önemlidir. Ortalama olarak, yuva kutuları haftada bir kez az miktarda suya ihtiyaç duyacaktır.</li>
	<li>Beslenme gerçekleştiğinde, çöpleri ve ölü bireyleri çıkarın. Bu malzemeleri normal çöp olarak atmadan önce tüm atıkları ve ölü karıncaları gece boyunca -30 ° C'de dondurun.</li>
	<li>Periyodik olarak kolonilere bir tutam kurutulmuş talaş ekleyin; Bu, larvaların yavrulaşmaya maruz kalmalarına yardımcı olur ve işçilerin yuva kutusunu temiz tutmasına yardımcı olur.</li>
</ol>2. Kuvars cam mikroenjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
<ol><li>Cam mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için bir mikropipet çektirici kullanın.</li>
	<li>Çekilecek camı seçin. Kullanılan camın tozsuz ve temiz bir ortamda saklandığından emin olun. NOT: Burada, mikroenjeksiyon iğneleri üretmek için dış çapı 1,0 mm, iç çapı 0,5 mm ve uzunluğu 7,5 cm olan ince duvarlı filamentli kuvars cam kullanılmıştır. Yumuşak gövdeli bir embriyo enjekte edilirse, borosilikat iğneleri de uygulanabilir, ancak borosilikat iğneleri sert koryona nüfuz edemez.</li>
	<li>Çektirmenin parametre ayarlarını yapın. H. tuzlayıcı embriyoları için mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için iki aşamalı bir işlem kullanın: ilk adım için parametreler arasında 575 ısı, 3 filament, 35 hız, 145 gecikme ve 75 çekme bulunur; İkinci adımın parametreleri arasında 425 ısı, 0 filament, 15 hız, 128 gecikme ve 200 çekme bulunur. İkinci adımı takiben, elde edilen iğnenin 2 mm'lik bir konik ve 0,5 μm'lik bir uca sahip olduğundan emin olun (Şekil 2). NOT: Bu parametre seti, diğer iğne tipleri için parametrelerle birlikte, Kullanım Kılavuzu17'de bulunabilir. Pipet çekiciler için kılavuzlar genellikle çeşitli teknikler için önerilen parametreleri sağlar. Hangi parametrelerin belirli ihtiyaçlar için en iyi iğneleri oluşturduğunu belirlemek için bazı deneme yanılma gerekebilir. Kısa bir konik, H. tuzlayıcı embriyolarının sert koryonuna nüfuz edebildiği için H. tuzlayıcı enjeksiyonları için idealdir . Dekoryonlanmış bir embriyo gibi yumuşak bir embriyo enjekte edilirse (örneğin, Drosophila), 10 mm civarında daha uzun bir konik daha iyi sonuçlar verebilir. Pipet çekiciler için kullanım kılavuzları genellikle farklı ihtiyaçlara uygun çekme iğneleri için özel parametreler sağlar. Cam filamentleri tutarken ve iğneleri çekerken eldivenlerin giyilmesi önemlidir. Eldiven giyilmediği takdirde çıplak ellerden gelen yağlar cama geçebilir.</li>
	<li>Parametreler ayarlandıktan sonra, mikroenjeksiyon için iğneleri çekmek üzere bir mikropipet çektirici kullanın. İğnelerin kullanılıncaya kadar tozsuz ve temiz bir ortamda muhafaza edildiğinden emin olun. NOT: Yeni çekilmiş mikroenjeksiyon iğnelerinin kullanılması tavsiye edilir. Önceden çekilmiş iğneler kullanılıyorsa, iğne uçlarının zarar görmesini ve potansiyel kontaminasyonu önlemek için bir kutuda uygun şekilde saklanmalıdır. Uzun süreli depolamaya tabi tutulan iğneler embriyo enjeksiyonları için önerilmez.</li>
</ol>3. Mikroenjektörün hazırlanması
<ol><li>İstenilen materyalleri karınca embriyolarına enjekte etmek için bir mikroenjektör kullanın.</li>
	<li>Cas9 proteinlerinin mikroenjeksiyon karışımını ve in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'ları (sgRNA'lar)10 hazırlayın. Bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleme zamanı gelene kadar karışımı buz üzerinde tutun. Kullanılmadığında, mikroenjeksiyon karışımını -80 ° C'de saklayın. NOT: Konsantrasyonlar farklı türlerde farklılık gösterir. Yüksek konsantrasyon yüksek mortaliteye neden olabilirken, düşük konsantrasyon verimliliği azaltabilir. H. saltator embriyo enjeksiyonu için 0.2 μg/μL Cas9 proteinleri ve 0.2 μg/μL sgRNA'lar kullanıyoruz. SgRNA'larımızın tasarımı daha önce kurulmuş bir protokololan 18'i takip etti. DNA veri tabanlarından gen dizileri elde edildi. H. saltator'un genom dizisi de daha önce19,20 olarak bildirilmişti.</li>
	<li>H. tuzlayıcı embriyoları için enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: 140 hektopaskal (hPa) enjeksiyon basıncı, 70 hPa'lık sabit bir basınç ve 0.4 saniyelik bir süre. Sabit basıncı, malzemenin yalnızca bir yönde akacağı şekilde ayarlayın. Enjeksiyon basıncını ve süresini yalnızca iğneden embriyoya hiçbir malzeme akmıyorsa ayarlayın. NOT: Farklı bir embriyo türü enjekte edilirse, değişebilecek birincil parametre, embriyodaki sıvının iğneye geri akmamasını sağlamaktan sorumlu olan sabit basınçtır. Bu protokolde ses seviyesi denetlenmez. Mikroenjektörün parametrelerinin ayarlanması, tutarlı enjeksiyonlar elde etmek için yeterlidir.</li>
	<li>Mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak karışımın 2 μL'si olan bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Karışımda kabarcık oluşmadığından emin olmak için bunu yavaşça yapın. NOT: Kabarcıklar oluşursa, tutarlı mikroenjeksiyonları sürdürmek zor olabilir.</li>
	<li>Bandın kenarı boyunca kırarak iğnenin sadece ucunu kırın, böylece dar bir konik hala korunur. İğnenin, ucun açılacağı kadar kırıldığından emin olun, ancak konikliğin kırıldığı kadar değil. NOT: Önemli olarak, iğnenin açıklığı kırıldıktan sonra çok genişse, kullanıcı enjeksiyon basıncı uygulanmadan önce basınçlı mikroenjektöre monte edildiğinde iğneden sıvı aktığını görecektir. Bazı mikroenjeksiyon protokolleri, ucu makasla keserek iğnelerin kırılmasını önerir. Makas, iğnenin ucunun parçalanmasına neden olabileceğinden bu yöntem önerilmez. Embriyoları parçalanmış bir iğne ile enjekte etmek oldukça zararlı olacaktır.</li>
	<li>İğneyi mikromanipülatöre monte edin</li>
</ol>4. Embriyo enjeksiyonu
<ol><li>Sinsityal aşamadan mikroenjeksiyon için embriyoları seçin: çekirdeklerin sitokinezi olmadan bölündüğü gelişim sırasında geçen süre. NOT: Bu, daha önce Drosophila21'de keşfedildiği gibi, mikroenjeksiyonla genom düzenleme için geliştirme sırasında ideal bir zamandır. H. tuzlayıcı embriyoları sinsitial aşamayı geçer ve yumurta birikimi10'dan yaklaşık 36 saat sonra selülariizasyona ulaşır. Enjeksiyonlar için daha genç embriyolar kullanılırsa daha yüksek verimlilik elde edilir.</li>
	<li>Bir cam mikroskop slaytına yapışmış çift taraflı bir bant parçası üzerindeki çizgi embriyoları. Enjeksiyon sırasında hareketi önlemek için embriyoların banda iyi sabitlendiğinden emin olun. Embriyoları, embriyonun yanal tarafı bandın kenarında olacak şekilde dikey yönde yerleştirin (Şekil 3). Slaytı ve sıralanmış embriyoları, belirlenmiş bir mikroenjeksiyon iş istasyonunda mikroskop sahnesine yerleştirin. NOT: Embriyoların, her enjeksiyonda iğne pozisyonunu ayarlamak yerine, slaytı sahnede hareket ettirerek ardışık enjeksiyonlar yapılabilecek şekilde düzenlenmesi önerilir. Bu, ardışık enjeksiyonların daha verimli bir şekilde yapılmasını sağlar.</li>
	<li>İğneyi mikromanipülatör kullanılarak enjekte edilecek ilk embriyo ile hizalayın (Şekil 4a).</li>
	<li>İğneyi mikroskop altında dorsal / ventral ekseni boyunca ilk embriyoya lateral olarak delin.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon karışımını enjekte edin. Embriyonun hafif hareketini arayın, enjekte edilen sıvı nedeniyle iç basınçta bir artış olduğunu gösterir. Ek olarak, embriyonun dış zarında gözle görülür doku ve / veya lipit izi içeren küçük bir damlacık oluşumunu izleyin (Şekil 4b). NOT: Damlacıkta doku ve/veya lipit izi bulunması, iğnenin embriyonun hem koryonunu hem de vitelin zarını başarıyla deldiğini gösterir. Bu malzemelerin izleri mevcut değilse, enjeksiyon başarılı bir şekilde gerçekleştirilmemiştir ve tekrarlanmalıdır. Birkaç saniye sonra, damlacık embriyo tarafından yeniden emilecek ve artık görünmeyecektir.</li>
	<li>İğneyi embriyodan derhal yavaşça çıkarın ve mikroskop slaytının konumunu ayarlayarak bir sonrakine geçin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar tekrarlayın.</li>
	<li>Slayttaki tüm embriyolar başarıyla enjekte edildikten sonra, slayttan çıkarılmadan önce embriyolara enjeksiyon işleminden iyileşmeleri için zaman tanımak için slaytı 1 saat boyunca nemli bir kutuya aktarın.</li>
</ol>5. Enjekte edilen embriyoların yetiştirilmesi
<ol><li>Nemli bir kutuda 1 saatlik inkübasyondan sonra, enjekte edilen embriyoları tüy ağırlıklı forseps kullanarak banttan yavaşça çıkarın ve az miktarda% 70 etanol ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Embriyoları tüpün dibine aktarmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın, ardından otoklavlanmış suyla üç yıkama yapın.</li>
	<li>Küçük ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak, enjekte edilen tüm embriyoları% 2 Antibiyotik-Antimikotik ile% 1 agar plakalarına aktarın. Antibiyotik-Antimikotik'i döküldükten sonra uygulayın agar plakaları bir hücre dağıtıcı kullanılarak plakanın yüzeyine yayılarak soğutuldu. Agar kurumasını önlemek için agar plakasını parafilm ile kapatın. NOT: Enjeksiyonlardan sonra enjekte edilen embriyoları bir koloniye geri göndermeye çalışmayın, çünkü işçiler enjekte edilen embriyoların çoğunu yok edebilir. Bu nedenle hayatta kalma, embriyoların normal koloni ortamının dışındaki agar plakalarında gelişmesine izin vererek optimize edilir.</li>
	<li>Agar plakalarını yaklaşık 4 hafta boyunca 25 ° C'de inkübe edin. Kuluçka için düzenli olarak kontrol edin.</li>
	<li>İlk embriyo bir larvaya yumurtadan çıktıktan sonra, tüm embriyoları ve larvaları, yavrulara bakmak için birkaç genç hemşire işçisiyle birlikte bir yuva kutusuna geri döndürün. Daha büyük bir vahşi tip koloni tarafından önceden sokulmuş cırcır böceklerini kullanarak besleyin, atık ürünleri çıkarın ve Bölüm 1'de tartışılan aynı protokolü izleyerek su ekleyin. NOT: Küçük kutular (9,5 x 9,5cm2) bu tür koloniler için idealdir. H. tuzlayıcı esaret altında iyi çoğalır. Bu nedenle, mutant embriyolar yetişkinliğe kadar yetiştirilebilir. Mutant yetişkinlerin izolasyonu, üreme gamergate aşamasına geçişi tetikler. Kontrollü haçlar, heterozigot veya homozigot bireylerle mutant koloniler oluşturmak için kullanılır (Şekil 5).</li>
</ol>

<ol><li>Evans, J. D., Wheeler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+during+honeybee+caste+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles during honeybee caste determination.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).</li>
<li>Keller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+the+genetics+of+social+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation and the genetics of social behaviour.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).</li>
<li>Cahan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+genetic+differences+between+queens+and+workers+in+hybridizing+Pogonomyrmex+harvester+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants.</a> Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).</li>
<li>Volny, V. P., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+queen-worker+dimorphism+in+a+social+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eusocial+insects+as+emerging+models+for+behavioural+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).</li>
<li>Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+ant+workers+capable+of+colony+foundation%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Are ant workers capable of colony foundation.</a> Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+reproduction+by+both+queens+and+workers+in+the+ponerine+ant+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator.</a> Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).</li>
<li>Trible, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((orco+mutagenesis+causes+loss+of+antennal+lobe+glomeruli+and+impaired+social+behavior+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants.</a> Cell. 170 (4), 727-735 (2017).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+orco+mutation+produces+aberrant+social+behavior+and+defective+neural+development+in+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants.</a> Cell. 170 (4), 736-747 (2017).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockout+mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Kohno, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKast+is+dispensable+for+normal+development+and+sexual+maturation+of+the+male+European+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+integration+and+expression+of+piggyBac-derived+cassettes+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+honeybee+%28Apis+mellifera%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+mediated+by+CRISPR%2FCas9+in+the+red+imported+fire+ant%2C+Solenopsis+invicta%5BTitle%5D)+AND+%22Insectes+Sociaux%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta.</a> Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002930(2012).</li>
<li>Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSutter%2C++%22Sutter+Instrument+Company%22">Sutter Instrument Company</a>. , (2012).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+color+vision+in+butterflies%3A+molecular+logic+behind+three+way+stochastic+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices.</a> Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+comparison+of+the+ants+Camponotus+floridanus+and+Harpegnathos+saltator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator.</a> Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).</li>
<li>Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assemblies+reveal+long+non-coding+RNAs+expressed+in+ant+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains.</a> Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).</li>
<li>Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenderson%2C+DS+%22Drosophila+Cytogenetics+Protocols%22">Drosophila Cytogenetics Protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Kern, R., Stobrawa, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKern%2C+R+%22Step-by-Step+Guide%3A+Microinjection+of+Adherent+Cells+with+the+Eppendorf+Injectman%C2%AE+4+and+Femtojet%C2%AE+4%22">Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4</a>. , (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Karıncalar, arılar, yaban arıları ve termitler de dahil olmak üzere böcekler arasında ösosyalliğin evrimi, birçoğunun çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan etkilendiği anlaşılan yeni davranışsal ve morfolojik özelliklerin ortaya çıkmasına neden olmuştur 1,2,3,4. Ne yazık ki, genetik alanında araştırma modelleri olarak ösosyal böceklerin çekiciliği ve kullanışlılığı, bu gruptaki m...

Böceklerde ösosyalliğin, yani Hymenoptera ve Blattodea (eski adıyla Isoptera) düzenlerinin evrimi, hem birey hem de koloni seviyelerinde ortaya çıkan benzersiz ve genellikle sofistike davranışsal özelliklerle sonuçlanmıştır. En gelişmiş sosyal böcek gruplarını karakterize eden bir özellik olan üreme işbölümü, genellikle davranışsal ve genellikle morfolojik olarak ayırt edici gruplardan oluşan kast sistemlerini içerir. Kastlar arasındaki bu tür davranışsal ve morfolojik çeşitlilik sadece genetik sistemleri tarafından değil, aynı zamanda çevre 1,2,3,4 tarafından da kontrol edilir ve bu da ösosyal böcekleri genetik ve epigenetik araştırmalar için çekici konular haline getirir.
Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etme yeteneğinin, birçok türün laboratuvar ortamlarında çiftleşmediği ve üremediği için zor olduğu kanıtlanmıştır. Çoğu ösosyal böcek ayrıca bir kolonide çok az sayıda üreme bireyine sahiptir, bu da üretilebilecek yavru sayısını sınırlar ve sonuç olarak genetik manipülasyon için örneklem boyutunu sınırlar5. Ek olarak, birçok ösosyal böcek, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan böceklere ( Drosophila gibi) kıyasla uzun nesil sürelerine sahiptir ve genetik çizgilerin oluşturulmasının zorluğuna katkıdabulunur 5. Bununla birlikte, bazı ösosyal türler, bir kolonide üreme açısından aktif bireylerin büyük bir bölümünü üretebilir, bu da zorlukları hafifletir ve mutant veya transgenik çizgiler oluşturma fırsatları sunar.
Poperin karınca türü Harpegnathos tuzlayıcısı söz konusu olduğunda, tüm kadın işçiler bir kraliçenin ölümü veya sosyal izolasyon üzerine üreme açısından aktif hale gelebilir. Bu işçilere "gamergates" denir ve yeni koloniler oluşturmak için kullanılabilir6. Ayrıca, bir kolonide birden fazla oyuncu kapısı bulunabilir, böylece yavru üretimi 5,7,8 artar. Şimdiye kadar, Avrupa bal arısı, Apis mellifera ve karınca türlerinde, H. saltator, Ooceraea biroi ve Solenopsis invicta9,10,11,12,13,14,15 mutant ve / veya transgenik çizgiler geliştirilmiştir. . Sosyal arılarda ve karıncalarda yapılan genetik analizler, ösosyalliğin daha iyi anlaşılmasına giden yolu açmış, genleri ve bunların ösosyal böcek davranışı ve kasta özgü fizyoloji üzerindeki etkilerini incelemek için bir dizi fırsat sağlamıştır.
Burada, H. saltator'daki CRISPR / Cas9 sistemi aracılığıyla genetik modifikasyon için bir protokol sağlıyoruz. Spesifik olarak, bu teknik, tüm koku verici reseptörlerin (OR'lar) zorunlu ko-reseptörünü kodlayan gen olan orco'da bir germline mutasyonu oluşturmak için kullanıldı10. OR genleri, hymenopteran eusocial böceklerinde16 önemli ölçüde genleşmiştir ve orko, böcek koku almada önemli bir rol oynamaktadır; yokluğunda, ameliyathaneler normal şekilde toplanmaz veya çalışmaz. Orko geninin mutasyonları bu nedenle koku alma hissini, sinirsel gelişimi ve ilişkili sosyal davranışları bozar 9,10.
Bu protokolde, Cas9 proteinleri ve küçük kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar), bir hedef genin mutagenezini indüklemek amacıyla mikroenjeksiyon kullanılarak karınca embriyolarına verilir. Burada, mikroenjeksiyon prosedürünü, kolonilerin ve enjekte edilen embriyoların bakımı ile ilgili talimatlarla birlikte ayrıntılı olarak açıklayacağız. Bu yöntemler, H. tuzlayıcı karıncalarında çeşitli farklı genlerde mutagenezi indüklemek için uygundur ve daha geniş bir hymenopteran böcek spektrumuna uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 proteini, NLS, yüksek konsantrasyonlu</td><td>PNA Bio</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>Selofan Rulo 20 inç X 5 fit</td><td>Hypogloss Ürünler</td><td>B00254CNJA</td><td>Ürünün birçok renk varyasyonu vardır. Karınca yuvaları yapmak için kırmızı olarak satın alın.</td></tr><tr><td>Eclipse Ci-S dik mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Ci-S</td><td></td></tr><tr><td>Tüy ağırlığı forseps, dar uçlu</td><td>BioQuip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet ll mikroenjektör</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Bu ürün artık Eppendorf tarafından satılmamakta veya desteklenmemektedir. Bunun yerine benzer bir mikroenjektör kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>NCBI veritabanı</td><td>Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi</td><td>Gen Kimliği: 105183395&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>P-2000 Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-2000/G</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kutular (19 X 13,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>079C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kutular (27 X 19 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>195C</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kutular (9,5 X 9,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>028C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filamentsiz kuvars cam</td><td>Sutter Instruments</td><td>Q100-50-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Vannas makas, 8.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Winsor & Newton Cotman Suluboya Serisi 111 Kısa Saplı Sentetik Fırça - Yuvarlak #000</td><td>Winsor ve Newton</td><td>5301030</td><td></td></tr></tbody></table>

karınca harpegnathos tuzlayıcısında crispr aracılı mutagenez için embriyo enjeksiyonları

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Sosyal davranış ve üreme işbölümü gibi ösosyal böceklerin benzersiz özellikleri, genetik sistemleri tarafından kontrol edilir. Genlerin sosyal özellikleri nasıl düzenlediğini ele almak için, sinsityal aşamalarında genç embriyolara CRISPR kompleksinin verilmesi yoluyla mutant karıncalar geliştirdik. Burada, çarpıcı fenotipik plastisite gösteren bir ponerin karınca türü olan Harpegnathos saltator'da CRISPR aracılı mutagenezinin bir protokolünü sunuyoruz. H. tuzlayıcı karıncalar laboratuvar ortamında kolayca yetiştirilir. Embriyolar, Cas9 proteinleri ile mikroenjeksiyon için toplanır ve ev yapımı kuvars iğneleri kullanılarak in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar). Enjeksiyon sonrası embriyolar koloni dışında yetiştirilir. İlk larvaların ortaya çıkmasından sonra, tüm embriyolar ve larvalar, daha fazla gelişme için birkaç hemşirelik çalışanı ile bir yuva kutusuna taşınır. Bu protokol, karıncalarda kasta özgü fizyoloji ve sosyal davranışların analizi için mutagenezi indüklemek için uygundur, ancak daha geniş bir hymenopteran ve diğer böcek spektrumuna da uygulanabilir.

Burada sağlanan protokol kullanılarak, Harpegnathos tuzlayıcı embriyolarında genom düzenlemesi başarıyla gerçekleştirildi. Bu sonuçlar, polimeraz zincir reaksiyonu ve enjekte edilen embriyolardan ekstrakte edilen DNA'nın pGEM klonlanması ve ardından DNA dizilimi ile doğrulandı. Bu protokolü kullanarak somatik mutagenezinin etkinliği yaklaşık% 40'a ulaştı. F1 mutant erkekleri, çiftleşmediği takdirde F3 erkekleri üreten heterozigot F2 dişileri üretmek için vahşi tip dişilerle çiftl...

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Bu protokol, genlerin sosyal bir ortamda iletişim ve davranıştaki işlevini anlamak için genetiği değiştirilmiş karıncalar üretmemizi sağlar. Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etmek zordur, çünkü birçok tür laboratuvar ortamlarında çiftleşmez ve çoğalmaz. Karınca hipernazal hücre tabanındaki çarpıcı fenotip plastisitesi, CRISPR aracılı mutant çizgiler oluşturmamızı sağlar.Prosedürü gösteren, bir laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olan Kayli Sieber olacak. H.saltator'un vahşi tip kolonilerini, 22 ila 25 santigrat derece arasında bir karınca yetiştirme odasında şeffaf plastik kutularda ve 12 saatlik bir ışık, 12 saatlik karanlık aydınlatma programında tutun. Bireysel işçileri veya küçük kolonileri desteklemek için küçük kutular ve daha büyük kolonileri desteklemek için orta veya büyük kutular kullanın.Yuva kutuları oluşturmak için, zeminleri yapmak için sıva kullanın. Islak sıva ortamda ve büyük kutularda kuruduğundan, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemek için sıvaya birkaç santimetre derinliğinde ve kutunun arkasından birkaç santimetre uzakta bir köpük blok bastırın. Sıva kuruduktan sonra, belirlenen yuva bölgesini kare bir cam parçası ile örtün.Kolonileri haftada i

embryo-injections-for-crispr-mediated-mutagenesis-ant-harpegnathos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Burada, CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenlemesi yoluyla genomlarını değiştirmek veya germline dönüşümü yoluyla işaretli transpoze edilebilir elementlerin eklenmesi amacıyla hücre öncesi mısır planthopper embriyolarının toplanması ve mikroenjekte edilmesi için protokoller bulunmaktadır.

Mısır Planthopper Mikroenjeksiyonu, Peregrinus maidis, CRISPR / Cas9 Genom Düzenleme için Embriyolar

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Bu çalışma, tatlı su elma salyangozu Pomacea canaliculata için stabil mutant hatların oluşturulması ve bakımı için bir iş akışı geliştirdi. Protokoller, zigotların toplanması, genom düzenlemesini teşvik etmek için CRISPR/Cas9 sistem bileşenleriyle mikroenjeksiyon, embriyoların ex ovo kültürü ve kontrollü çaprazlamalardan sonra genotipleme gibi konuları içerir.

Altın Elma Salyangozu Pomacea canaliculata: Zigotlardan Stabil Mutant Hatlara

Öğrenin karınca embriyolarına CRISPR aracılı mutagenez için mikroenjeksiyon yöntemini. Harpegnathos saltator'da genetik modifikasyonla iletişim ve davranış genlerinin işlevini sosyal bağlamda inceleyin.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Daha fazla video keşfet