Contactvrij co-kweekmodel voor de studie van innate immuuncelactivering tijdens respiratoire virusinfectie

Dit protocol is ontworpen om overspraak van epitheelcellen en eerstelijns aangeboren immuuncellen te onderzoeken, met name aangeboren T-cellen, wat ons interesseert. Primaire cellen uit menselijke bronnen worden gebruikt in deze techniek, waardoor individueel onderzoek van fysiologische overspraak relevant is voor wat er bij mensen gebeurt. Aangeboren T-cellen zijn betrokken bij het verbeteren van de overleving van influenza-geïnfecteerde patiënten.

Weten hoe ze worden geactiveerd, kan helpen bij het ontwikkelen van anti-influenza en antivirale therapie. Deze methode is ontworpen om factoren te identificeren die de aangeboren T-cellen kunnen activeren, wat kan helpen bij het ontwikkelen van preventieve maatregelen tegen respiratoire virusinfectie. Infecteer op dag nul menselijke neusepitheelcellen of HNECs.

Tel eerst cellen door 150 microliter 1x trypsine EDTA toe te voegen aan de apicale kamer van de membraaninzet en 350 microliter 1x trypsine EDTA aan de basale kamer van de representatieve put. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten of totdat de cellen loskomen van het membraan. Spoel de cellen op het membraan door op en neer te pipetteren en vang de suspensie op in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg 200 microliter DMEM toe om de trypsine-activiteit te dempen. Tel vervolgens cellen via trypan blauwe kleuring. Bereken de vereiste veelheid van infectie, of MOI, van het virus op basis van het celgetal per put.

Verdun de virusvoorraad dienovereenkomstig met volledige RPMI op ijs. Voeg voor de resterende putten voor het infectie-experiment één 1x DPBS toe aan de apicale kamers van de membraaninzetstukken. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en verwijder de 1x DPBS.

Verander het basale medium in de membraaninzetstukken om het RPMI-medium te voltooien door de wisselplaten over te brengen naar een nieuwe plaat met volledige RPMI toegevoegd aan de putten. Voeg het bereide virus-entmateriaal toe aan de apicale kamer van de membraaninzet. Incubeer bij 35 graden Celsius in een 5% koolstofdioxideatmosfeer gedurende een uur en verwijder het virale entmateriaal uit de apicale kamer.

Verander het basale medium van de membraaninzet in vers RPMI-medium en incubeer bij 35 graden Celsius in een 5% kooldioxide-atmosfeer gedurende 24 tot 72 uur. Zaai het vereiste aantal mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, in volledig RPMI-medium door de PBMC-suspensie vanaf dag nul rechtstreeks toe te voegen aan de basale kamer van elke put geïnfecteerde HNEC's. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur.

Om het apicale supernatant te verzamelen, voegt u 1x DBPS toe aan elke apicale kamer en incubeert u gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel vervolgens de DPBS in buizen van 1,5 milliliter. Aliquoteer het supernatant voor de plaquetest in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en vries zowel de bouillon als de aliquots onmiddellijk in bij min 80 graden Celsius.

Om RNA-vormige HNEC's te verzamelen, brengt u de membraaninzet over naar een schone put. Voeg RNA-lysisbuffer toe aan de apicale kamer en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het supernatant in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar het bij min 80 graden Celsius tot RNA-extractie voor moleculaire analyse.

Oogst ten slotte PBMC's door het oppervlak van de put voorzichtig te schrapen met de brede basis van een steriele pipetpunt om de geactiveerde PBMC's los te maken die zich mogelijk aan het putoppervlak hechten. Verzamel het basale medium met PBMC's in een centrifugebuis van twee milliliter. Spoel de putjes twee keer door met 300 microliter 1x DPBS en verzamel de was in dezelfde buis van twee milliliter.

Centrifugeer de buis van twee milliliter en verzamel het supernatant in een verse buis van twee milliliter zonder de celkorrel te verstoren. Bewaar het geaspireerde supernatant bij min 80 graden Celsius voor cytokine- en chemokineanalyse. Resuspend de resterende celkorrel in 200 microliter 1x DPBS.

Dit protocol kan worden gebruikt om aangeboren T-cellen na influenza-infectie te bestuderen zonder de noodzaak van epitheliale en immuuncellen van dezelfde donor. Een voorbeeld van de verwachte progressie van de HNESPC's terwijl ze groeien op de 3T3-feederlaag wordt hier weergegeven. Deze werden gebruikt voor differentiatie in de lucht/ vloeistof interface cultuur om meerlagige HNEC's te verkrijgen met functionele, trilhaar- en gobletcellen.

Met behulp van de HNECs kan aangeboren T-celactivering worden onderzocht met behulp van flowcytometrie. Deze resultaten tonen de detectie van mucosaal-geassocieerde invariante T- of MAIT-cellen, V delta één, gamma delta T-cellen en de natural killer T- of NKT-cellen. Deze cellen waren significant verhoogd in co-kweek met HNECs geïnfecteerd met influenzavirus.

Deze opstelling kan vervolgens worden toegepast op andere influenzavirusstammen of aangeboren immuuncelpopulaties om hun respectieve activering onder co-kweekomstandigheden met geïnfecteerde epitheelcellen te observeren. Nauwkeurige berekening van het aantal menselijke neusepitheelcellen om ervoor te zorgen dat de juiste multipliciteit van infectie wordt gebruikt, is belangrijk voor optimale niveaus en timing van activering. Kruisverwijzing tussen epitheelcellen en aangeboren immuuncellen krijgt steeds meer aandacht, en dit kan verder worden toegepast op andere methoden waarbij acute of chronische respiratoire immunologie betrokken is.