Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Dit protocol resulteert in reproduceerbare en betrouwbare chromatine-extractie uit bevroren levermonsters voor chromatine-immunoprecipitatie-experimenten. Plaats om te beginnen de buis met het bevroren weefsel in de mortel en laat deze daar vijf minuten zitten. Oefen vervolgens druk uit op het monster met behulp van een voorgekoelde stamper totdat er geen vaste kruimels meer zijn.

Verwijder de buis met het monster uit de mortel. Voeg 950 microliter ijskoude PBS toe met de vereiste remmers en pipetteer voorzichtig op en neer totdat het monster volledig is geresuspendeerd. Breng de weefselsuspensie onmiddellijk over naar de homogenisator en breng 20 tot 30 slagen aan met Pestle A om een fijnere suspensie te verkrijgen.

Vermijd het verplaatsen van de stamper buiten de vloeibare fase om schuimvorming te voorkomen. Breng het homogenaat over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter die eerder op ijs is gekoeld. Centrifugeer de buis vervolgens gedurende vijf minuten op 1, 300 G en vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspendeer de pellet volledig in 950 microliter PBS op kamertemperatuur door voorzichtig pipetteren. Voeg vervolgens 63,6 microliter 16% methanolvrij formaldehyde toe om een eindconcentratie van 1% te verkrijgen Draai de buis onmiddellijk gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na rotatie 113 microliter 1,25 molaire glycine bij kamertemperatuur toe om een eindconcentratie van 125 millimol te verkrijgen en draai de buis nog eens vijf minuten.

Centrifugeer het monster vervolgens gedurende drie minuten bij 1.300 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet voorzichtig door 950 microliter ijskoude PBS in te pipetteren met de vereiste remmers. Centrifugeer het monster opnieuw en resuspensie van de pellet zoals eerder is aangetoond.

Herhaal de centrifugatiestap nogmaals en ga onmiddellijk verder met de chromatine-isolatieprocedure. Voeg 950 microliter Buffer A met de benodigde remmers toe aan de pellet en meng voorzichtig door pipetteren totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Draai de buis vervolgens 10 minuten op vier graden celsius.

Centrifugeer het monster na rotatie gedurende vijf minuten bij 2.000 G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant voorzichtig. Voeg 950 microliter Buffer B met de benodigde remmers toe aan de pellet en meng voorzichtig door pipetteren totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Draai de buis vervolgens 10 minuten op vier graden celsius.

Na rotatie centrifugeert u het monster opnieuw. Verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 300 microliter kamertemperatuur Buffer C met de benodigde remmers krachtig toe aan de pellet en pipet.

Draai het monster gedurende 15 tot 30 seconden. Draai vervolgens kort aan de buis om de druppels op het deksel te verzamelen. Voeg na het soniceren van het chromatinemonster 30 microliter 10% Triton X-100-oplossing en vortex toe gedurende vijf tot 10 seconden.

Centrifugeer het monster bij 16.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. En breng het supernatant over in een schone buis van 1,5 milliliter die voorgekoeld op ijs ligt. Breng 10 tot 25 microliter geschoren chromatine over in een nieuwe buis en voeg buffer C toe om een eindvolume van 200 microliter te bereiken.

Aliquot en shock bevriezen de rest van het chromatine bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Voeg acht microliter van vijf molair natriumchloride toe en incubeer gedurende ten minste zes uur bij 65 graden Celsius in het verwarmingsblok tijdens het schudden bij 1.000 RPM. Verleng de incubatie indien mogelijk een nacht.

Nadat u de monsters vijf minuten bij kamertemperatuur hebt laten afkoelen, voegt u twee microliter RNase A toe en incubeert u gedurende een uur bij 37 graden Celsius terwijl u schudt bij 1.000 RPM. Verwijder de monsters uit het verwarmingsblok en voeg zeven microliter 300 millimolair calciumchloride en twee microliter proteïnase K. Incubeer de monsters in het verwarmingsblok bij 56 graden Celsius gedurende 30 minuten tijdens het schudden bij 1.000 RPM. Bereid ondertussen één fasescheidingsbuis voor elk monster voor door ze gedurende één minuut bij vier graden Celsius tot 16.000 G te centrifugeren.

Nadat u de buizen uit het verwarmingsblok hebt verwijderd en ze gedurende drie minuten bij kamertemperatuur hebt laten balanceren, brengt u 400 microliter van het monster over naar de eerder gecentrifugeerde fasescheidingsbuis. Voeg vervolgens 400 microliter fenolchloroform isoamylalcoholoplossing en vortex gedurende vijf seconden toe. Centrifugeer de buis op 16.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Voeg vervolgens 400 microliter chloroform en vortex toe gedurende vijf seconden. Centrifugeer de buis nog eens vijf minuten en breng 400 microliter van de bovenste fase over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter die 24 microliter vijf molair natriumchloride en 0,75 microliter glycogeen bevat. Draai vervolgens kort de buis.

Voeg 1.055 microliter 100% ethanol toe. Draai vervolgens grondig en incuber het monster bij min 80 graden Celsius gedurende een uur of bij min 20 graden Celsius gedurende een nacht. Nadat de incubatie is voltooid, centrifugeert u het monster gedurende 30 minuten bij 16.000 G bij vier graden Celsius en verwijdert u het supernatant voorzichtig zonder de pellet te ontwrichten.

Voeg 500 microliter koude 70% ethanol toe en kantel de buis voorzichtig om ervoor te zorgen dat de pellet wordt gewassen. Centrifugeer de buis op 16.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het hele supernatant en laat de pellet drogen bij kamertemperatuur.

U kunt de buis ook incuberen op 37 graden Celsius voor een snellere droging. Voeg 50 microliter Tris-EDTA-oplossing toe en plaats de buis gedurende vijf tot 10 minuten op het verwarmingsblok onder schudden bij 300 RPM. Analyseer vervolgens het DNA op een 1% agarose-gel.

Na decross-linking van chromatine en visualisatie van het DNA op agarosegel, kan succesvol scheren worden herkend aan de aanwezigheid van fragmenten in het bereik van 100 tot 300 basenparen. Het chromatine werd met succes neergeslagen met H3K4-trimethylatie, H3K27-acetylering en H3 K27-trimethylatieantistoffen en verder geanalyseerd door qPCR. Chromosoom één open leesframe 43, proteasoom 20S subunit bèta twee en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenasepromotorregio's die actief in de lever worden getranscribeerd, vertoonden verrijking voor H3K4-trimethylatie en H3K27-acetylering.

Ter vergelijking: homeobox C13, homeobox C12 en de muismyelinetranscriptiefactor één promotorregio's die in de lever tot zwijgen worden gebracht, werden niet verrijkt zoals verwacht. H3 K27-trimethylatie vertoont het tegenovergestelde gedrag, waardoor het succes van de chromatine-immunoprecipitatie of ChIP-test wordt bevestigd. Het chromatine werd met succes onderworpen aan ChIP-Seq.

Na de sequencing werd het riet uitgelijnd met een eerder voorbereide index en gescheiden volgens soort. H3K4-trimethylatie en H3K27-acetyleringsafzetting op gentranscriptiestartplaatsen geantagoneerd met H3K27-trimethylatiedepositie zoals verwacht. De Hox C-cluster staat erom bekend transcriptioneel inactief te zijn in zowel muizen- als menselijke levers.

De profilering van H3K4-trimethylatie en H3K27-acetylering toont pieken voor deze twee posttranslationele modificaties buiten het cluster, terwijl de signaalintensiteit van H3K27-trimethylatie de neiging heeft toe te nemen binnen het gencluster. Chromatine-extractie uit bevroren weefselmonsters heeft een hoge intrinsieke variabiliteit, sterk afhankelijk van de fijnheid en temperatuur van de celsuspensie tijdens crosslinking. Het waarborgen van vaste laboratoriumomstandigheden helpt bij het handhaven van de reproduceerbaarheid van het fragmentgroottebereik.