Name: Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 Cryo soft X-ray tomography를 이용한 세포의 3D 정량적 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 염색이나 절단 없이 미토콘드리아, 소포체 등 세포 소기관을 고해상도로 시각화하여 감염 및 질병 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 75439에 따라 유럽 집행위원회 호라이즌 2020 iNEXT-Discovery 프로젝트와 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원받았습니다.

<ol><li>Carrascosa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+X-ray+tomography+of+vaccinia+virus+membranes+and+inner+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments.</a> Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> PNAS. 106, 19375-19380 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 10, 1-3 (2010).</li>
<li>Chichón, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+nano-tomography+of+vaccinia+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells.</a> Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).</li>
<li>Kepsutlu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+undergo+major+changes+in+the+quantity+of+cytoplasmic+organelles+after+uptake+of+gold+nanoparticles+with+biologically+relevant+surface+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings.</a> ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).</li>
<li>Natterer, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatterer%2C+F+%22The+mathematics+of+computerized+tomography%22">The mathematics of computerized tomography</a>. , Wiley. New York. (1986).</li>
<li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computed+tomography+of+cryogenic+biological+specimens+based+on+X-ray+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images.</a> Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).</li>
<li>Clowney, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+aggregation+of+olfactory+receptor+genes+governs+their+monogenic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression.</a> Cell. 151, 724-737 (2012).</li>
<li>Duke, E. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+endosomes+and+autophagosomes+in+whole+mammalian+cells+using+correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+microscopy+%28cryo-CLXM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM).</a> Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).</li>
<li>Cinquin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+molecules+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Putting molecules in their place.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).</li>
<li>Hagen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nanoparticles+as+alignment+and+correlation+markers+in+fluorescence%2Fsoft+X-ray+cryo-microscopy%2Ftomography+of+nucleoplasmic+reticulum+and+apoptosis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).</li>
<li>Pérez-Berná, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+cells+images+by+soft+X-ray+cryo-tomography+during+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection.</a> ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).</li>
<li>Chiappi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography+as+a+quantitative+three-dimensional+tool+to+model+nanoparticle%3Acell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, 15(2016).</li>
<li>Varsano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+correlative+cryo-soft+X-ray+tomography+and+stochastic+reconstruction+microscopy.+A+study+of+cholesterol+crystal+early+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182, 1-16 (2020).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+quinoline+antimalarial+drugs+in+red+blood+cells+infected+by+Plasmodium+falciparum+revealed+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo.</a> PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+intracellular+localization+and+quantification+of+a+potent+iridium+anticancer+compound+by+correlative+3D+cryo+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging.</a> Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).</li>
<li>Gal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native-state+imaging+of+calcifying+and+noncalcifying+microalgae+reveals+similarities+in+their+calcium+storage+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles.</a> PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).</li>
<li>Procopio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+fingerprint+of+Zn-hydroxyapatite+in+the+early+stages+of+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation.</a> ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).</li>
<li>Kahil, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+calcium+transport+and+concentration+toward+mineral+formation+in+sea+urchin+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae.</a> PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticles+mass+quantification+by+near-edge+absorption+soft+X-ray+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography.</a> Scientific Reports. 6, 22354(2016).</li>
<li>Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+modulation+transfer+function+of+an+X-ray+microscope+based+on+multiple+Fourier+orders+analysis+of+a+Siemens+star%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star.</a> Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).</li>
<li>Otón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transfer+function%2C+resolution+and+depth+of+field+of+a+soft+X-ray+microscope+applied+to+tomography+enhancement+by+Wiener+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution.</a> Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).</li>
<li>Messaoudi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chemical+mapping+by+EFTEM-TomoJ+including+improvement+of+SNR+by+PCA+and+ART+reconstruction+of+volume+by+noise+supression%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression.</a> Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+tomographic+reconstruction+on+multicore+computers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast tomographic reconstruction on multicore computers.</a> Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17, 50-54 (2020).</li>
<li>Attwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAttwood%2C+D+%22Soft+X-rays+and+Extreme+Ultraviolet+Radiation.+Principles+and+Applications%22">Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).</li>
<li>Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowells%2C+M+%22Principles+and+Applications+of+Zone+Plate+X-ray.+Microscopes.+Science+of+Microscopy%22">Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy</a>. , Springer. New York. (2007).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+image+browser%3A+a+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Luengo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuRVoS%3A+Super-region+volume+segmentation+workbench%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench.</a> Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

샘플 준비는 고품질의 부드러운 X 선 단층 촬영을 얻는 중요한 단계이며, 그 품질은 샘플 유리화의 품질과 세포가 내장되어있는 얼음층 두께에 직접적으로 달려 있습니다. 신호 대 잡음비가 높은 프로젝션은 얼음층이 얇은 지역에서 수집되어 가능한 가장 높은 분해능을 달성하는 데 필요한 방사선 선량을 최소화할 수 있습니다. 또한, 셀 컨플루언시는 또한 최종 토모그램 품질에 영향을 미치는데, 이는 회전 시 이웃 셀이 FoV에 들어가는 것을 피해야 하기 때문이다. 마지막으로, Au 신탁 마커의 올바른 분산은 프로젝션 정렬의 정확도를 결정한 다음 궁극적으로 최종 3D 재구성 볼륨의 품질을 결정합니다. 그리드에 Au 신탁을 적절히 분산하면 프로젝션 정렬 단계의 자동화가 가능하며, 이 단계가 없으면 이러한 중요한 단계에 대한 높은 전문 지식이 필요합니다.
본 명세서의 프로토콜은 단지 하나의 가능한 샘플 준비 전략을 묘사하며, 이는 냉동 전자 단층 촬영 (cryo-ET)에 사용되는 것들과 유사성을 갖는다. 두 경우 모두, 더 나은 재현성을 위해 까다로운 샘플 준비를 개선하는 프로토콜이 이러한 기술의 성공을 위한 기본이 될 것이며, 이러한 목표(29)를 향한 노력이 이루어지고 있다. 격리된 세포를 영상화하는 것 외에도, 조직을 통한 전달 신호가 높은 기울기 각도에서 충분할 것이라는 점을 제공하면 조직의 절편도 시각화될 수 있다는 것을 언급할 가치가 있다. 일반적으로 이것은 몇 미크론 (10 μm 미만)의 섹션을 의미합니다.
셀 내부의 특정 구조나 이벤트를 이미지화하려면 이 특정 기능이 틸트 시리즈의 FoV 내부에 있는지 확인해야 합니다. cryo-SXT에서 FoV는 렌즈에 따라 10 x 10 μm2 내지 15 x 15μm2로 제한되고 분해능의 픽셀 오버샘플링을 적어도 2배로 차지하므로, 종종 전체 셀 확장보다 작다(도 5에 표시된 적색 사각형 참조). 따라서 ROI를 찾고 적절하게 표시해야합니다. 이것은 일반적으로 형광 태그와 가시 광선 상관 관계 접근법을 통해 수행됩니다. 소프트 X선 투과 현미경이 통합된 온라인 가시광선 형광 현미경을 가지고 있기 때문에 에피형광을 결합하는 2D 전략은 간단하지만, 고분해능 2D 또는 3D 형광 신호에 대한 다른 접근법도 사용할 수 있습니다 4,12,13,15,16 . 이러한 경우 그리드를 초해상도 현미경과 같은 특정 장비에서 먼저 이미징해야 합니다. 가장 효율적인 상관 관계 접근법은 극저온 조건에서 데이터 수집과 관련된 접근법입니다. 이는 실온 (RT), 가시광선 형광 이미징, 및 샘플 유리화 사이의 시간 경과가 예를 들어, 시간에 맞는 세포 이벤트를 포착하는 것을 방해하기 때문이다; 또한, 유리화 절차는 RT에서 이미지화된 관심 셀을 그리드로부터 분리할 수 있다. 대부분의 상관 관계 이미징 접근법이 샘플 그리드를 조작하고 한 장비에서 다른 장비로 운반해야한다는 것을 암시 할 수 있으며, 그리드 오염 또는 손상의 위험이 증가하더라도 세포 환경 내에서 특정 사건이나 분자를 정확히 지적 할 수 있다는 보상은 분명합니다.
전체 세포 영상화가 요구될 때, 적용된 총 선량이 방사선 손상 한계를 초과하지 않는 한 상이한 단층촬영을 바느질할 수 있다. 보통, 동일한 세포 상에서 몇 개의 단층체를 수집하기 위한 기탁된 투여량은 달성 가능한 해상도(10,9 Gy)에서 한계보다 훨씬 낮으며, 따라서, 투여량을 낮추기 위해 특별한 전략이 요구되지 않지만, 이것은 샘플- 및 실험-의존적이다. 분광 단층 촬영과 같은 집중적 인 데이터 수집의 경우 실제로 복용량을 최소화해야하며 편리한 데이터 수집 및 특정 처리 전략을 적용해야합니다.
Cryo-SXT에는 몇 가지 제한 사항이 있으며 여기에서 언급해야합니다. 첫 번째는 잘 알려진 누락 된 쐐기로, 평평한 샘플 지지대를 사용하는 데 필수적입니다. 180도 회전을 허용하는 모세관 샘플 지지대는 과거에 사용되어 왔으며 일부 시설에서도 여전히 사용되었지만 유리 흡수 및 현탁액에서 세포 사용 제한으로 인한 빈곤 한 대비와 같은 단점도 있습니다. 누락 된 쐐기의 효과를 줄이는 방법은 이중 틸트 단층 촬영을 수행하는 것입니다. 이것은 실제로 요즘 미스트랄 빔 라인에서 가능합니다. 두 번째 한계는 이러한 현미경에 사용되는 프레넬 존 플레이트 렌즈에 의해 설정된다. 이 렌즈는 달성 가능한 최고의 해상도와 피사계 심도(DoF)를 설정하며, 둘 다 밀접하게 관련되어 있습니다. 이것은 해상도를 높이면 DoF가 감소하는 반면 셀의 두께는 종종 더 커질 것임을 의미합니다. 예를 들어, 40nm 렌즈는 이론적으로 3μm의 DoF와 24.4nm 하프 피치의 분해능을 가질 것이다. 따라서 해상도와 DoF 사이의 절충안은 전략적이며 렌즈의 선택은 셀30,31의 유형에 따라 달라집니다. 마지막으로, 전 세계적으로 작동하는 TXM은 이상적인 현미경과는 거리가 멀고 이론적 인 기대에 도달하기 위해 광학 시스템을 개선하기위한 노력이 이루어지고 있습니다. 마지막으로, 재구성된 볼륨의 시각화 및 세분화는 특정 소프트웨어 도구(25,32,33,34)로 수행될 수 있다.
요약하면, cryo-SXT는 중간 분해능 (25-30 nm 하프 피치) 및 통계적 수치 (하루에 수십 개의 토모그램)에서 세포를 정량적으로 이미징 할 수 있습니다. 이를 통해 특정 조건, 예를 들어 병원균 감염 또는 질병 중, 정확한 시점 또는 특정 치료 후 소기관의 조직, 분포 및 치수를 얻을 수 있습니다. 따라서, 이는 보다 일반적인 전자 및 가시광선 현미경에 유용한 상보적인 생물학적 이미징 기술이며, 이들 각각은 샘플 치수 및 분해능의 특정 범위를 다루어준다. Cryo-SXT는 가시광선 형광을 포함하는 상관관계 접근법에 자주 사용되지만, 다른 cryo 상관관계 전략도 가능하다.

Cryo-SXT는 수화된 전체 세포 1,2,3,4,5,6의 3D 배지 분해능(25-30nm 하프 피치) 부피를 제공하기 때문에 생물학적 이미징 연구에서 중심적인 역할을 할 수 있습니다. 물 창 에너지 범위에서, 탄소와 산소 흡수 K 가장자리 (4.4-2.3 nm) 사이에서, 탄소가 풍부한 세포 구조는 그들을 투과하고 둘러싸고있는 산소가 풍부한 매질보다 10 배 더 많이 흡수합니다. 이 에너지 범위에서 최대 10 μm 두께의 유리화 된 세포는 절편이나 염색 없이도 이미징 할 수 있으므로 정량적 인 고 흡수 대비 돌출부가 생겨 샘플 회전 기능과 결합하여 세포 구조의 단층 촬영 재구성을 허용합니다. Cryo-SXT는 다른 이미징 기술로는 쉽게 접근 할 수없는 시편 치수 및 공간 해상도 측면에서 틈새 시장을 채 웁니다.
간단히 말해서, cryo-SXT의 흡수 콘트라스트는 두께 t의 표본을 통한 광자의 감쇠가 다음과 같이 Beer-Lambert 법칙을 따르기 때문에 정량적이다: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;">여기서 I0은 입사 강도를 나타내고 μl은 시편의 굴절률의 파장 λ 및 허수 부분 β에 의존하는 선형 흡수 계수를 나타낸다(<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;"> ). 감쇠는 이미지화되는 구조물의 생화학적 조성 및 두께의 함수이며, 각 생화학적 성분은 특정 X선 선형 흡수 계수 μl(LAC)을 갖는다. 이것은 각 단층 촬영 복셀 값이 화학 원소와 복셀7에서의 농도에 달려 있음을 의미합니다. 이것은 핵, 핵, 지질 몸체 또는 미토콘드리아와 같은 다른 소기관의 자연적 차별을 허용하거나, 단지 그들의 고유 한 LAC 값 재구성 2,8,9에 기초한 염색질의 다른 압축 상태를 허용합니다.
또한 cryo-SXT는 단층 촬영이 몇 분 안에 수집되는 높은 처리량 기술입니다. 이것은 특히 분열, 분화 및 아폽토시스와 같은 주요 시점에서뿐만 아니라 특정 약물 요법 또는 병원성 감염에 대한 화학적 노출에 의해 유도 된 것과 같은 다른 반응 상태에서도 포획 될 수있는 세포 집단의 메조 스케일 이미징을 가능하게합니다. 이러한 핵심 지점에서 수집 된 데이터는 특정 순간에 다른 세포 소기관의 공간 조직에 대한 충실한 기록과 함께 시스템의 3D 설명을 제공합니다.
 보통, cryo-SXT는 3D 세포 환경 4,10,11,12,13,14,15,16, 또는 경질 X선 형광 데이터(17,18) 내에서 특정 특징, 사건 또는 거대분자를 위치시킬 수 있도록 하는 상관학적 접근법에 따르는 다른 기술들과 함께 사용된다. . 극저온 조건에서의 상관 관계 접근법은 관심 시스템에 대한 가장 완전하고 가치있는 그림을 얻기 위해 가장 중요합니다. Mistral (Alba) 및 B24 (다이아몬드) cryo-SXT 빔라인의 일반적인 워크플로우에 대한 간략한 요약이 그림 1에 스케치되어 있습니다.
더욱이, 싱크로트론 시설에서의 파장 튜닝 능력을 이용하여, 분광학적 정보는 샘플에 포함된 특정 원소의 특정 차등 흡수를 사용하는 구조적인 것 이외에 얻어질 수 있다. 이것의 예는 세포19,20,21에서 생물 미네랄화 과정에 대한 연구에서 칼슘의 위치입니다. 아래의 다른 광자 에너지(spectra) 또는 토모그램에서 그리고 관심 있는 x-레이 흡수 가장자리에서 2D 이미지를 촬영함으로써, 선택된 요소를 포함하는 픽셀 또는 복셀이 식별될 수 있다. 스펙트럼은 또한 화학적 상태를 분화시키는 것을 허용한다(즉, 이전의 생물광물화 실시예20에서와 같이 비정질 칼슘이 하이드록시아파타이트로 진화됨). 서로 다른 요소의 정량화는 2D 및 3D에서 가능합니다. 유리화된 세포의 분광학적 이미징은 전형적으로 물 윈도우에서 행해지지만, 수분 함량이 충분히 낮거나 탈수를 포함한 다른 샘플 준비 프로토콜이 사용되는 경우 다른 에너지 범위에서도 가능하다(22). 상세한 분광법 단계별 프로토콜은 본 명세서에서 프로토콜의 초점을 벗어난다.
다음 내용에서 프로토콜은 주요 샘플 준비 단계를 간략하게 요약하는 데 중점을 두지만 각 시스템은 개별 개선이 필요할 수 있지만 냉동 소프트 X 선 단층 촬영을위한 자세한 단계별 데이터 수집 절차가 뒤 따릅니다.

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>소프트웨어 세분화</td></tr><tr><td>Au Holey Carbon Films&nbsp; 파인더 그리드</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2 Au G200F1</td><td>Au Holey 탄소 필름 파인더 그리드</td></tr><tr><td>Au 나노 입자</td><td>&nbsp; BBI 그룹, 카디프, 영국</td><td>Au 나노 입자 100nm</td><td>100 nm Au 나노 입자 (NPs) at Mistral (Alba)</td></tr><tr><td>Au 나노 입자</td><td>&nbsp; BBI Group, Cardiff, UK</td><td>Au 나노 입자 250nm</td><td>250 nm Au 나노 입자 (NP) at B24 (다이아몬드)</td></tr><tr><td>Axio Scope A1</td><td>Zeiss</td><td>430035 9060</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>블로팅 No.1 여과지</td><td>Whatman</td><td>WHA10010155</td><td>블로팅 필터</td></tr><tr><td>Bsoft</td><td></td><td></td><td>소프트웨어 프로젝션 정렬, 재구성 및 시각화 (Heymann et al., 2008)</td></tr><tr><td>키메라</td><td></td><td></td><td>세분화를 위한 소프트웨어 (Pettersen et al. 2004)</td></tr><tr><td>Cryo-EM 글로우 방전 세트</td><td>PELCO easiGlow</td><td>91000S</td><td>글로우 방전 클리닝 시스템</td></tr><tr><td>Cu Holey Carbon Films&nbsp; 파인더 그리드</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2Cu G200F1</td><td>Cu Holey 탄소 필름 파인더 그리드</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>열 비활성화, 멸균 필터링, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Java의 이미지 처리 및 분석을 위한 소프트웨어(NIH & LOCI University of Wisconsin)</td></tr><tr><td>투영 정렬, 재구성 및 시각화를 위한 IMOD</td><td></td><td></td><td></td> 소프트웨어 (Kremer et al., 1996)</tr><tr><td>Leica EM GP Grid Plunger</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>Automatic Plunge Freezer EM</td></tr><tr><td>LINKAM cryo-stage</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS 196</td><td>Cryo-Correlative Microscopy Stage</td></tr><tr><td>MIB</td><td></td><td></td><td>분할용 소프트웨어(Belevich et al. 2016)</td></tr><tr><td>P100 페트리 접시</td><td>Sigma</td><td>P6106</td><td>세포 배양 및 멸균 처리</td></tr><tr><td>P60 페트리 접시</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td>세포 배양 및 멸균</td></tr><tr><td>처리 폴리리신</td><td></td><td>P4707</td><td>폴리-L-라이신 용액 0.01%, 멸균 여과</td></tr><tr><td>소프트 X-선 현미경 0.25-1.2keV</td><td>Xradia</td><td>NCT-SB</td><td>Transmission soft 세분화를 위한 X-Ray microscope</td></tr><tr><td>SURVOS</td><td></td><td></td><td>소프트웨어&nbsp; (루엔고 외. 2017)</td></tr><tr>재건을 위한 <td>Tomo3d</td><td></td><td></td><td>소프트웨어 (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)</td></tr><tr>재건을 위한 <td>TomoJ</td><td></td><td></td><td>소프트웨어 (ART) (Messaoudi et al., 2007)</td></tr><tr><td>XM 데이터 탐색기</td><td>Zeiss</td><td></td><td>TXM 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

cryo soft x선 단층 촬영에 의한 세포의 3d cartographic 설명

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

이미징 기술은 생물학적 연구 및 관련 분야에서 세포 조직 및 기계를 이해하기 위해 기본입니다. 이러한 기술 중에서 냉동 소프트 X 선 단층 촬영 (SXT)은 탄소 구조가 본질적으로 물보다 높은 흡수력을 갖는 물 창 X 선 에너지 범위 (284-543 eV)에서 전체 냉동 보존 세포를 이미징 할 수있게하여 각 복셀에 포함 된 재료의 선형 흡수 계수를 3D 재구성 할 수 있습니다. 최대 10 μm 두께의 전체 세포 수준에서 정량적 구조 정보는 25-30 nm 하프 피치까지 높은 처리량과 공간 분해능으로 이러한 방식으로 달성 할 수 있습니다. Cryo-SXT는 세포 감염 과정 (바이러스, 박테리아 또는 기생충), 질병 (예 : 열성 유전 질환)으로 인한 형태 학적 변화에 대한 3D 정보를 제공하고 세포 수준에서 약물 작용을 이해하거나 3D 세포 환경에서 특정 구조를 찾는 데 도움이되는 현재의 생물 의학 연구와 관련이 있음이 입증되었습니다. 또한, 싱크로트론 시설에서의 파장 조정 가능한 파장을 이용함으로써, 분광-현미경 또는 그의 3D 대응물, 분광-단층 촬영, 또한 생체 미네랄화 공정에서 칼슘과 같은 세포 내의 특정 원소를 이미지화하고 정량화하는 데 사용될 수 있다. Cryo-SXT는 전자 현미경, X선 형광 또는 가시광선 형광과 같은 다른 생물학적 이미징 기술에 상보적인 정보를 제공하며, 일반적으로 기능, 위치 및 형태를 연결하기 위해 극저온 조건에서 2D 또는 3D 상관 영상화를 위한 파트너 방법으로 사용됩니다.

cryo-SXT용 샘플을 준비하는 것은 어려울 수 있습니다. 동일한 샘플 그리드 내에서도 그림 5에서 볼 수 있듯이 동일한 Au 파인더 격자의 두 사각형을 보여 주는 이상적인 영역과 이상적이지 않은 영역을 가질 수 있습니다. 이상적인 샘플은 사각형 메쉬의 중앙에 단일 셀이 있어야하며, 얇은 얼음 층에 내장되어 있어야하며 단층 촬영 재구성 전에 틸트 돌기의 정렬에 사용되는 잘 분산 된 Au 신탁 마커로 둘러싸여 있어야합니다. 도 5A는 이들 기준의 다수를 준수하는 섬유아세포형 세포(NIH 3T3)를 도시한다. 시야각(FoV)을 나타내는 빨간색 박스로 표시된 영역의 ART27 을 이용한 3D 재구성으로부터의 단일 슬라이스가 도 5B에 도시되어 있다. 미토콘드리아(M), 소포체(ER), 소포(V) 및 핵(N)과 같은 많은 상이한 소기관들은 LACs의 정량적 재구성 덕분에 구별될 수 있다. 또한, 재구성의 신호 대 잡음비는 매우 높아 세포 특징의 높은 콘트라스트를 달성할 수 있게 한다. 한편, 도 5C는 더 높은 셀 밀도를 갖는 사각형을 나타낸다. 이 때문에 블롯팅은 일반적으로 효율성이 떨어지며 얼음층이 두꺼워 지거나 유리화 문제가 발생합니다. 일부 경우에, 이것은 X선 이미징 전에 에피형광 매핑을 사용하여 그리드를 스크리닝할 때 이미 관찰될 수 있으며, 이러한 그리드는 어떠한 비용으로도 피해야 한다. 도 5C에서, 격자 내의 균열 및 유리화된 얼음이 전체 메쉬 사각형(적색 화살표로 표시됨)을 통과하는 것을 관찰할 수 있다. 균열 근처의 모든 이미징은 빔에 노출 될 때 그리드의 불안정성 때문에 피해야합니다. 또한, 균열은이 지역의 경우와 같이 두꺼운 얼음의 징후가 될 수 있습니다. 틸트 시리즈가 빨간색 상자로 표시된 영역에 기록되었습니다. 도 5D에서, 대응하는 3D 재구성으로부터의 단일 슬라이스가 도시된다. 일부 더 큰 구조물이 인식 될 수 있지만, 예를 들어 화살표가 가리키는 상부 미토콘드리아에서 구체적으로 볼 수 있듯이 두꺼운 얼음의 유리화 품질이 좋지 않기 때문에 소음과 거친 질감 내에서 미세한 세부 사항이 손실됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg"> 그림 1: 워크플로 cryo-SXT 데이터 수집 전에 회로도 워크플로우가 뒤따랐습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg"> 그림 2: 그리드에서 성장하는 세포. (A) P100 페트리 접시에서 약 80%-90%의 합류율을 보이는 세포. (b) P60 페트리 접시와 세포를 시딩한 후 여러 격자를 가한다. (c) 세포는 24시간 후에 격자 상부에서 성장한다. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg"> 그림 3: 샘플 홀더와 이송 챔버에 그리드 를 적재합니다. (A) 그리드를 적재할 준비가 된 셔틀 및 냉동 박스로 액체 질소로 채워진 워크스테이션. (B) 그리드가 적재 된 상태에서 로더에 삽입 된 샘플 홀더. (C) 덮개 없이 위치 3에 있는 샘플 홀더와 셔틀. (D) 이송 챔버가 부착된 워크스테이션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg"> 그림 4: TXM(A)에 샘플을 로딩하고 전사 챔버를 TXM에 부착. (B) TXM 내부 셔틀. (c) TXM 로봇 암이 샘플 홀더를 샘플 스테이지 내로 삽입한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg"> 도 5: 냉동 소프트 X선 단층 촬영의 예. 상부 행: 이상적인 샘플, (A) 중앙에서 분리된 세포를 나타내는 격자 사각형의 2D 모자이크 도면. (B) 재구성된 3D 볼륨으로부터 하나의 슬라이스가 레드 박스(A)로 표시된 영역을 나타낸다. (D)에 비해 이미지가 훨씬 부드럽고 더 많은 세부 사항이 표시됩니다. 아래쪽 행: 비이상적인 샘플, (C) 얼음 및 그리드 호일에 너무 높은 셀 합류도와 균열을 보여주는 그리드 사각형의 2D 모자이크 보기(빨간색 화살표). (d) 재구성된 3D 볼륨으로부터 하나의 슬라이스가 (C)에서 레드 박스로 표시된 영역을 나타낸다. 불량하거나 차선책의 유리화는 이미지의 거친 질감으로 식별 할 수 있습니다. N: 핵; M: 미토콘드리아; ER: 소포체; MV: 다소포체; V: 액포; 스케일 바: A &amp; C 20 μm; B &amp; D 2 μm.V<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Cryo Soft X선 단층 촬영은 독립형으로 또는 다른 이미징 기술과 함께 사용할 수 있는 세포 수준에서 정량적으로 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 염색 또는 절편화가 필요한 동결된 수화 상태의 센서 이미지. 또한 각 단층 촬영이 단 몇 분 만에 수집되기 때문에 처리량이 높은 기술입니다.소프트 X선 냉동 단층 촬영은 단일 세포 수준에서 감염되거나 결함이있는 세포에서 세포 복원 과정을 따르기위한 완벽한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 새로운 항바이러스 약물 또는 유전자 요법의 효능을 보고하여 편집된 표현형의 감염을 되돌릴 수 있다. 투과 X선 현미경에 샘플을 적재하려면 100켈빈 미만에 도달할 때까지 액체 질소로 이송 챔버를 냉각하십시오.워크 스테이션을 추가 액체 질소로 채우고 워크 스테이션 림의 히터를 켭니다. 워크스테이션 림이 끓는 것을 멈추면 그리드가 들어있는 냉동 상자를 냉동 조건에서 워크스테이션의 적절한 위치에 놓고 그리드를 이전에 냉각된 샘플 홀더에 로드합니다. 홀더를 셔틀에 싣고 덮개로 보호하십시오.셔틀을 100켈빈 미만의 이송 챔버에 적재하고 챔버를 저진공으로 펌핑합니다. 이송 챔버를 현미경에 부착하고 화면의 진공 절차를 따라 이송 챔버 셔틀을 현미경으로로드하십시오. 셔틀이 샘플과 함께 현미경에 있으면 현미경 로봇 암을 사용하여 하나의 샘플 홀더를 샘플 스테이지로 옮깁니다.온라인 가시 광선 현미경으로 그리드의 밝은 필드 이미징을 위해 가시 광선 현미경 카메라를 선택하고 밝은 필드 이미징을 위해 가시 광선 현미경 LED 소스를 켭니다. 동작, 제어, 샘플 및 샘플 세타를 클릭하여 샘플을 영하 60도로 회전하여 가시광선 현미경 목표를 향하도록 한 다음 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 X와 샘플 Y를 변경하여 샘플을 예상 중심 위치로 이동합니다. 현미경, 수집, 수집 설정, 수집 모드, 연속 및 시작을 선택하고 모션 제어 및 샘플을 클릭하여 샘플 Z를 선택하여 셀 및/또는 탄소 지지 필름의 구멍에 초점을 맞출 때까지 다섯 미크론까지 더 작은 단계로 초점을 미세화합니다.그런 다음 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 선택하여 모자이크의 기본값을 사용하여 밝은 필드 모드에서 그리드의 전체 모자이크 맵 획득을 시작합니다. 형광 모드 모자이크 이미징의 경우 밝은 필드 이미징을 위해 가시광선 현미경 LED 소스를 끄고 원하는 여기 파장에 해당하는 LED 광원과 해당 광학 필터를 수동으로 선택하십시오. 현미경, 수집, 수집 설정, 수집 모드, 연속 및 시작을 선택하고 모션 제어 및 샘플을 클릭하여 샘플 Z를 선택하여 형광 이미지에 초점을 맞춥니다.그런 다음 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 클릭하여 밝은 필드 모자이크에서 위치 X 및 Y 매개 변수를 유지하는 모자이크 맵을 가져옵니다. 그런 다음 LED 광원을 끕니다. X선 모자이크 수집의 경우, 출구 슬릿을 다섯 미크론으로 변경하고 MISTRAL에서 1초 노출을 사용합니다.현미경, 수집, 수집 설정, 카메라 설정 및 비닝을 선택하여 샘플 Z 변환을 사용하여 초점을 조정합니다. 모션 컨트롤 및 샘플을 선택하여 샘플 Z를 선택합니다.5미크론 단계부터 셀이나 카본 호일 구멍에 초점이 맞춰질 때까지 초점을 0.5미크론 단계로 세분화합니다. 메쉬 사각형의 모자이크 맵을 가져오려면 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 클릭합니다.맵을 획득하면 동작 제어 및 샘플을 클릭하고 샘플 X와 샘플 Y를 변경하여 샘플을 플랫 필드 위치로 이동합니다. MISTRAL에서 노출 시간을 일초로 설정합니다. 그 후, 획득한 모자이크를 평탄한 필드 영상에 의해 정규화하여 전송을 획득하고 정규화된 모자이크를 저장한다.회전 축의 샘플을 영도에서의 회전과 정렬하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 X, 샘플 Y 및 샘플 Z를 변경하여 회전 축에 배치할 셀의 피쳐에 초점을 맞춥니다. 샘플을 양의 세타 위치로 회전하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 세타를 양수 세타로 변경합니다. 선 도구를 사용하여 셀의 피쳐에 선을 그려 회전 축을 배치합니다.샘플을 음수 세타 위치로 회전하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 세타를 음수 세타로 변경합니다. 선 도구를 사용하여 셀의 피쳐에 선을 그려 회전 축을 배치합니다. 양수 또는 음의 세타 위치에 있는 동안 샘플 Z 변환을 사용하여 선택한 피쳐를 두 선 사이의 중심 위치로 이동하고 최소 라인 간 거리가 확보될 때까지 샘플 회전을 반복합니다.샘플 세타가 0이면 선택한 피쳐를 시야각의 중앙에 배치하는 데 필요한 거리의 두 배로 샘플 X를 이동하고 영역 플레이트 X를 이동하여 피쳐를 다시 시야각의 중앙으로 가져옵니다. 새 회전 축에 대해 영역 플레이트 Z 위치를 다시 최적화하려면 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드 및 초점 시리즈를 선택하고 시작을 클릭하여 영역 플레이트 Z 초점 시리즈를 기록합니다. 그런 다음 모션 컨트롤 및 존 플레이트를 클릭하고 영역 플레이트 Z를 선택하여 영역 플레이트 Z를 샘플이 초점이 맞춰진 위치로 이동합니다.토모그램을 얻으려면 동작 제어 및 샘플을 클릭하고 샘플 세타를 선택하여 음의 최대 각도를 더하기 0.1로 이동합니다. 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드 및 단층 촬영을 클릭하여 각도 0 및 각도 범위의 이미지를 고려하여 이미지 수를 총 각도 수로 설정하고 이미지 수를 설정합니다. 앵글 시작 및 앵글 엔드를 선택하고 현미경, 획득, 획득 설정, 카메라 설정을 클릭하고 노출 시간을 설정합니다.시작을 클릭하여 단층 촬영 틸트 시리즈의 수집을 시작합니다. 이상적인 샘플은 얇은 얼음 층에 내장 된 사각형 메쉬의 중앙에 단일 셀이 있어야하며 잘 분산 된 금 신탁 마커로 둘러싸여 있어야합니다. 미토콘드리아, 소포체, 액포 및 핵과 같은 많은 다른 소기관들은 선형 흡수 계수의 정량적 재구성 덕분에 최종 재구성된 단층 촬영에서 구별될 수 있어야 한다.이 이미지에서는 더 높은 셀 밀도를 가진 사각형을 관찰 할 수 있습니다. 이 예에서, 블롯팅은 덜 효율적이었고, 균열이 있는 더 두꺼운 얼음층으로 이어졌다. 이 준비에서 일부 더 큰 구조물을 인식 할 수 있지만, 두꺼운 얼음의 유리화 품질이 좋지 않아 소음과 거친 질감 내에서 미세한 세부 사항이 손실되었습니다.냉동 보존 샘플은 최소한으로 처리되어야 하는데, 이는 대부분의 아티팩트가 이 단계에서 샘플이 생성될 때 유도되기 때문입니다. 보통, 상관관계 cryo-가시광선 광현미경 검사는, 냉동 기판 단층 촬영 전에 사용한다. 또한, 스펙트럼 현미경 검사는 관련 화학 원소에서 수행 할 수 있습니다.이 프로토콜은 다른 직접 이미징 기술로 쉽게 접근 할 수없는 시편 및 해상도 체계에서 작동하여 틈새 시장을 채우고 몇 미크론과 30 나노 미터 반 피치 해상도를 허용합니다.

a-3d-cartographic-description-cell-cryo-soft-x-ray

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

초저온 전자 단층촬영(cryo-ET)을 사용하면 나노미터 분해능에서 세포 초미세 구조를 3D로 시각화할 수 있지만 수동 분할은 여전히 시간이 많이 걸리고 복잡합니다. 우리는 cryo-ET 단층촬영을 위한 고급 가상 현실 소프트웨어를 통합한 새로운 워크플로우를 제시하고, 포유류 세포의 미토콘드리아를 분할하여 그 효과를 보여줍니다.

초저온 전자 단층촬영(cryo-electron tomography) 데이터의 몰입형 세분화 및 분석을 위한 가상 현실 활용

배우세요 Cryo soft X-ray tomography를 이용한 세포의 3D 정량적 구조 분석 방법입니다. 이 기술은 염색이나 절단 없이 미토콘드리아, 소포체 등 세포 소기관을 고해상도로 시각화하여 감염 및 질병 연구에 활용됩니다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

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