Name: 인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 인간 가래 샘플에서 FRET 프로브와 유세포 분석을 이용한 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활성 정량화 방법. 이 기술은 중성구성 기도 질환의 항염증 치료 평가와 바이오마커 검증에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 독일 교육 연구부(FKZ 82DZL004A1~M.A.M)와 독일 연구 재단(SFB-TR84TP B08~M.A.M)의 보조금에 의해 지원되었다. 이 원고에 설명된 작품은 M.G.에 대한 박사 펠로우십을 통해 독일 폐 연구 센터 (DZL)와 EMBL 하이델베르크에 의해 지원되었다. J. S. 채터니, S. Butz 및 H. Scheuermann에게 전문적인 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다.

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<li>Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bright+Future+for+Precision+Medicine%3A+Advances+in+Fluorescent+Chemical+Probe+Design+and+Their+Clinical+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application.</a> Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).</li>
<li>Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+monitoring+of+neutrophil+elastase+activity+with+ratiometric+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).</li>
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<li>Craven, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-silent+FRET+Sensor+Enables+Live+Cell+Imaging+and+Flow+Cytometric+Stratification+of+Intracellular+Serine+Protease+Activity+in+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13490(2018).</li>
<li>Mu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+fret+reporter+for+the+real-time+visualization+of+cell-surface+proteolytic+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

보고된 프로토콜은 인간 가래 견본에 있는 호중구 엘라스테아제 및 카테핀 G의 활동을 정량화하기 위하여 다른 접근을 설명합니다. 성공적인 효소 활성 측정을 위한 중요 점은 i) 수술 절차및 ii)의 정확한 타이밍 및 표준화이며, 신뢰할 수 있는 음수 및 양성 제어의 사용이다. 이러한 조건이 충족되는 경우, 기술된 방법은 가래에 국한되지 않고 혈액, 기관지정맥용암혈액 및 조직 단면 또는 균질화의 프로테아제 활성 분석에 쉽게 적응될 수 있다.
세 가지 기술은 각각 강점과 한계를 가지고 있으며, 종종 서로를 보완합니다. 예를 들어, 유동 세포측정은 세포 피노핑뿐만 아니라 희귀 세포 집단의 신속한 분석을 허용하지만 현미경 검사법에 의해 달성 될 수있는 공간 해상도 정보가 부족합니다. 대신 플레이트 판독기 측정을 통해 여러 샘플 또는 조건의 병렬 평가를 높은 처리량 방식으로 허용합니다. 신선한 가래 세포를 동결하고 저장할 수 없기 때문에 세 가지 방법은 시료를 예상 후 신속하게 처리해야합니다. 이를 통해 멤브레인 결합 활동 측정의 유연성이나 처리량을 제한합니다. 프로브 추가 및 효소 분열 후 세포를 고칠 수 있는 유동 세포측정 프로토콜의 개발은 더 많은 수의 튜브의 병렬 측정에 개방될 것이다. 또한 FRET 프로브의 처리 및 보관에 특히 주의를 기울여야 합니다. 실제로, 메티오닌과 같은 펩티드 기판에 존재하는 일부 아미노산은 산화를 거쳐 기자 민감도가 저하된다. 기자의 유통기한(20°C에서 약 3개월 추정)을 높이기 위해 질소 나 아르곤과 같은 불활성 가스 하에서 소량 의 알리쿼트(1-2 μL)에 보관할 수 있다.
CF 및 기타 만성 염증성 폐 질환에서는 가능한 한 빨리 염증을 감지하는 것이 중요하며 신뢰할 수 있는 바이오마커는 그러한 목표를 달성할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 주변 조직에 유해한 것으로 나타난 표면 경계 NSP 활성을 검출할 수 있는 가능성은 또한 자유 NE 활성이 없거나 거의 없는 조건에서, 다른 기존 방법4,11을통해 거의 달성될 수 없는 또 다른 수준의 귀중한 정보를 추가한다.
기자는 폐 질환의 심각도 및 진행, 특히 초기 발병시 막 에 묶인 NSP 활동의 링크를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 치료 효능(예를 들어, 항염증제 치료 또는 매우 효과적인 CFTR 변조기 및전위제(28)을모니터링하고 호중구 구동 염증의 결과 완화를 조사하는 데 활용될 수 있다. 또한, 프로토콜은 환자를 위한 아주 낮은 리스크를 전송하는 비침습적 견본 절차를 기반으로 하고, 그러므로, 아주 넓은 규모로 이용되고 수많은 흥미진진한 응용에 문을 열 수 있습니다.

호중구 엘라스타제(NE), 카테핀 G(CG), 단백질라제 3(PR3) 및 호중구 세린 프로테아제 4(NSP4)는 4개의 호중구 세린 프로테아제(NSP)1이다. 그(것)들은 호중구 1차 또는 azurophilic 과립 내의 myeloperoxidase와 더불어 저장됩니다. 그들의 높은 proteolytic 콘텐츠로 인해, 1 차 과립의 분비성은 엄격하게 통제되고 호중구는 자극2를프라이밍하고 활성화로 순차적으로 도전되어야 합니다.
phagolysosome 내부, NSP는 세포 내 bactericidal 에이전트로 기능3. 분비될 때, NSP는 염증의 강한 중재자가 된다: 그들은 사이토카인과 표면 수용체를 갈라, 병렬 프로 염증 경로활성화 3. 중요한 것은, 선동적인 조건은 통제되지 않는 NSP 분비를 특징으로 합니다. 예를 들어, 염증이 있는 기도 내에서, 과도한 NE 활성은 점액 과분비, 잔세포 대사증, CFTR 불활성화 및 세포외 매트릭스 리모델링4,5를일으킨다. 카테신 G는 염증에도 참여한다: 특히 IL-1 제품군, IL-36α 및 IL-36β6의2개의 성분을 절단하고 활성화한다. NE와 함께, CG 는 기도 상피에 프로테아제 활성화 수용체를 만들고 또한 TNF-α 및 IL-1β를 활성화합니다.
알파-1-항트립신, 알파-1-항키모트립신 및 분비류 백혈구 프로테아제 억제제와 같은 내인성 항프로테아제는 호중구 엘라스타제 및 카테프신 G 활성5를조절한다. 그러나, 폐질환 진행 과정에서 프로테아제의 지속적인 분비액은 항프로테아제 쉴드를 능가하여 기도내의 비해결 호중구증, 염증 악화 및 조직 손상5,7을초과한다. 환자 기도의 수용성 분획에서 의 NE 농도 및 활성은 질병 심각도8의유망한 바이오마커로 나타났지만, NE및 CG는 또한 정전기상호 작용을 통해 호중구 막 및 세포외 DNA에 연관되어 항 프로테아제에 덜 접근할 수 있게 된다. 중요한 것은, 전임상 연구는 세포 표면 관련 프로테아제 활성이 수용성 대응4,11과독립적으로 나타나는 시나리오를 정의하였다. 사실, 검출될 수 있게 하려면, 무료 프로테아제 활동은 먼저 프로테아제 방지 방패를 압도해야 합니다. 대신, 세포 표면에서 막 결합 프로테아제 활성은 세포 플라즈마멤브레인(12)에큰 억제제가 접근할 수 없기 때문에 적어도 부분적으로 그대로 남아 있다. 이러한 복잡한 protease 행동은 호중구 매개 염증 발병 및 전파에 중요한 결과를 가지고, 따라서 정확하고 유익한 도구로 조사 할 필요가있다.
수년에 걸쳐, Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 프로브는 효율적이고 빠르게 인간의 샘플에서 특정 protease 활동을 평가하는 도구로 수많은 생체 의학 응용 프로그램을 발견13. 프로테아제 기자는 표적 효소에 의해 인식되고, 내분에 기증자 불소호가 수용체 분자로 에너지를 전달하는 물리적 과정인 FRET에 의존하는 인식 모티프(즉, 펩티드)로 구성된다. 리포터에 효소에 의해 작용하는 처리, 즉 인식 부분의 분열, 기증자로부터 확산되는 수용인의 결과: 효소 활성은 따라서 수용자 형광을 통해 기증자의 시간 의존적 변화로 측정된다. 이러한 판독은 자체 정상화 및 비율 메트릭이므로 pH 및 로컬 프로브 농도와 같은 환경 조건에 의해 약간만 영향을 받습니다. NEmo-114 및 sSAM15는 NE 및 CG 활성에 대해 각각 구체적으로 보고하는 FRET 프로브입니다. 그러나, 이러한 리포터는 임의의 셀룰러 구획에 특별히 국소화하지 않으므로 인간의 유체에 존재하는 프로테아제 활동을 모니터링하기 위해 사용됩니다. 공간적으로 국소화된 방식으로 프로테아제활성을 모니터링하기 위해, 우리 및 다른 사람들은 분자태그(14,15,16,17,18,19)를통해 세포전 과소 성분과 연관된 FRET 프로브를 개발하였다. 이러한 합성 전략은 혈장 멤브레인에 국한지질 앵커가 장착 된 두 개의 FRET 프로브인 NEmo-2 및 mSAM의 개발을 허용했습니다. 이 기자들은 낭포성 섬유증과 만성 폐쇄성 폐질환14,15에서NE와 CG 프로테아제의 깊은 이해를 촉진시켰다.
여기서, 상세한 프로토콜은 NEmo 및 SAM 시리즈 FRET 프로브를 통해 인간 가래에서 수용성 및 멤브레인 바운드 NE 및 CG 활동의 시각화 및 정량화를 위해 제공됩니다. NSP 병리학의 다양한 측면을 해결하고 사용자 별 필요에 따라 사용할 수 있는 다양한 방법을 제공하기 위해 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포측정법을 통한 분석이 도시되어 있다.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; m 나일론 셀 스트레이너</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>2300 EnSpire (멀티라벨 플레이트 리더)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35x10mm 접시, Nunclon Delta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 나일론 셀 스트레이너</td><td>Corning Inc.</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>10535253</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD, 생존도 염료</td><td>Bio Legend</td><td>420404</td><td>5 &micro; L/100 &마이크로; L</td></tr><tr><td>저울</td><td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>PR124</td><td></td></tr><tr><td>BD 팔콘 둥근 바닥 튜브 5mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa 세포 분석기</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블랙 플랫 바텀 96 웰 절반 면적 플레이트</td><td>Corning Life Science</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>Cathepsin G</td><td>Elastin Products Company</td><td>SG623</td><td></td></tr><tr><td>Cathepsin G Inhibitor I</td><td>Merck KGaA</td><td>219372</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418R</td><td>Eppendorf AG</td><td>EP5401000137</td><td></td></tr><tr><td>Combitips advanced 1.0 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>0030 089 430</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete proteinase inhibitor</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Countig chambers improved Neubauer</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG</td><td>40442</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 &오슬래시; 25mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MENZCB00250RA003</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (핵 염색)</td><td>BioStatus Limited</td><td>DR50050</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FACSDiva 소프트웨어, v8.0.1</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcBlock</td><td>BD Bioscience</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>피지(피지는 이미지J)</td><td>fiji.sc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo 소프트웨어, v10</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoQ 플러그인, v3-97</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 객담 백혈구 엘라스타제</td><td>엘라스틴 제품 회사</td><td>SE563</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 컨포칼 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td></td><td></td></tr>즈 <tr><td>Mini Rock-Shaker</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>MR-1</td><td></td></tr><tr><td>마우스 반인간 CD14, Pe-Cy7, 클론 M5E2</td><td>BD Bioscience</td><td>557742 Lot : 8221983</td><td>1:50</td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD16, AF700, 클론 3G8</td><td>BD Bioscience</td><td>557820 Lot : 8208791</td><td>1:50</td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD45, APC-Cy7, 클론 2D1</td><td>BD Bioscience</td><td>557833 Lot:8059688</td><td>1:33</td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 CD66b, PE/Dazzel 594, 클론 G10F5</td><td>BioLegend</td><td>305122 Lot : B241921</td><td>1:50</td></tr><tr><td></td><td>mSAM in house</td><td></td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Multipette plus</td><td>Eppendorf AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEmo-1</td><td>SiChem</td><td>SC-0200</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NEmo-2E</td><td>SiChem</td><td>SC-0201</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Pari Boy SX with an LC Sprint jet 분무기</td><td>Pari</td><td>085G3001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt (장착 매체)</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol</td><td>Teva GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sivelestat</td><td>Cayman Chemicals</td><td>17779</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin</td><td>Calbiochem</td><td>560000-1SET</td><td></td></tr><tr><td></td><td>sSAM in house</td><td></td><td>2 mM</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 접착 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 g 활동 모니터링

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases는 수많은 생리 과정의 규제 기관이며 활동의 정확한 조사는 흥미로운 생물 의학 과제로 남아 있습니다. 인간 게놈에 의해 인코딩된 ~600개의 프로테아제 중 호중구 세린 프로테아제(NSP)는 호흡기 질환을 포함한 염증조건의 발병 및 진행에 관여하는 것에 대해 철저히 조사된다. 유일하게, 분비된 NSP는 세포외 유체 내에서 확산될 뿐만 아니라 플라즈마 멤브레인에 국한됩니다. 호중구 세포 외 함정 (NETs) 형성 중, NSP는 분비 된 크로마틴의 필수적인 부분이된다. 이러한 복잡한 동작은 NSP 병리학에 대한 이해를 어려운 작업으로 만듭니다. 여기서, 상세한 프로토콜은 가래 샘플에서 무료 및 막 바인딩 호중구 엘라스테아제(NE) 및 카테신 G(CG) 활동을 시각화, 정량화 및 차별하는 것으로 나타났다. NE와 CG는 낭포성 섬유증 (CF) 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 발병기막에 흉골 역할을하는 NSP입니다 : 그들은 조직 리모델링을 촉진하고 다운 스트림 면역 반응을 조절하며 폐 질환 심각도와 상관 관계가 있습니다. 프로토콜은 작은 분자 Förster 공명 에너지 전송 기지를 둔 (FRET) 기자를 통해 효소 활동 정량화를 위한 인간 가래에서 neutrophils의 격리뿐만 아니라 액체 및 세포 분획을 분리하는 방법을 보여줍니다. NE 및 CG 활동의 상대적 역할에 대한 구체적인 통찰력을 수집하기 위해 FRET 판독값은 다양한 기술로 측정할 수 있습니다: i) 시험관 내 플레이트 판독기 측정은 프로테아제 활성의 높은 처리량 및 대량 검출을 허용합니다. ii) 공초점 현미경 검사는 세포 표면에서 막 결합 활성을 현체적으로 해결; iii) 소분자 FRET 유동 세포측정은 단일 세포 프로테아제 활성 정량화 및 페노티핑을 통한 항염증제 치료의 신속한 평가를 가능하게 한다. 이러한 방법의 구현은 CF 및 COPD에 대한 질병 심각도의 바이오 마커로 NSP 병리학 및 잠재력을 탐구하는 문을 엽니 다. 표준화 잠재력, 강력한 판독 가능성 및 전송 단순성을 감안할 때, 설명된 기술은 연구 및 진단 실험실 전반에 걸쳐 구현을 위해 즉시 공유할 수 있습니다.

도 1a에 표시된 결과는 대표적인 현미경 데이터 집합을 도시한다. 핵 신호는 그들의 특징적인 분할된 핵에 의해 호중구를 확인하기 위하여 이용됩니다. 관심 영역(ROI)은 수동으로 선택됩니다(도 1a의파선). D/A 비율 이미지는 기증자 채널의 강도를 픽셀단위로 수락자 채널의 강도로 나누어 계산합니다. 마지막 단계에서 셀당 평균 D/A 비율이 계산됩니다.] 도 1b에서 각 점은 하나의 ROI(호중구)의 평균을 나타낸다. 조건당 약 100개의 세포를 이미지화하고 평가하는 것이 좋습니다.
대표적인 유동 세포측정제 게이팅 전략은 도 2a에도시된다. 이러한 게이팅은 가래 호중구를 차별하고 연구할 수 있습니다. 형광 유출 또는 보상 아티팩트를 방지하려면 FRET 프로브 형광 검출에 레이저 라인(예: 블루 레이저)을 헌납하는 것이 좋습니다. 유동 세포종형 보정은 FRET 프로브가 아닌 항체에 대해 수행되어야 한다. 그림 2b는 리포터 추가 후 0분과 10분 후에 MFI 분포를 묘사합니다. 도 2c의 각 행은 1000 개의 가래 호중구에 대한 평균 기증자 및 수용자 MFIs 값을 나타냅니다. D/A 비율은 기증자와 수락자 MF를 분할하여 계산됩니다. 오른쪽 도 2c의 시간 과정은 측정의 진행을 보여줍니다 : 빠른 초기 증가 후, D / A 비율은 막 바인딩 효소의 활성에 따라 고원에 도달한다.

본 명세서에 설명된 프로토콜은 인간 가래에서 호중구 프로테아제의 활성을 시각화하고 정량화하는 가이드를 제공한다. 이러한 분석의 적용은 항염증제 치료의 평가에서부터 바이오마커 검증, 약물 스크리닝 및 대형 코호트 임상 연구에 이르기까지 지속됩니다.

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

당사의 FRET 프로브 및 프로토콜은 호중구기도 질환을 가진 환자로부터 가래로 자유롭고 표면에 묶인 엘라스타제 및 카테스핀 G 활성의 신속하고 민감한 정량화를 가능하게 합니다. 이러한 방법은, 프로테아이즈 병리학의 다른 측면을 탐구할 수 있도록 합니다. 플레이트 판독기 측정은 대형 스크리닝을 허용합니다.공초점 현미경 검사는 세포 외 용액으로 효소 활성을 시각화합니다. 유동 세포측정을 하면서 단일 세포 phenotyping및 프로테아제 활성 정량화를 개인화된 방식으로 가능하게 합니다. 이 기술은 낭포성 섬유증, 기관지혈증 또는 COPD와 같은 다른 기도 질병으로 확장될 수 있습니다.그리고 혈액 이나 기관지 알베올라 용암 또는 마우스 샘플과 같은 다른 바이오 샘플에 적응 될 수있다. 가래 유도 절차를 시작하기 전에, 베타 2 수용체 길항제 살부타몰의 200 마이크로그램을 흡입한다. 그 후 분무기를 사용하여 15 분 동안 고독 6 % 식염수 용액을 흡입하십시오.페트리 요리로 기대되는 가래를 모으세요. 타액에서 튀는 점액을 파이펫 팁의 도움으로 페트리 접시에 넣습니다. 점액의 무게를 측정한 다음 가래에 10%스푸토리신과 PBS의 중량당 4개의 부피 부품을 추가합니다.점액을 용해하기 위해 흔들 셰이커에 실온에서 혼합물을 15 분 동안 배양합니다. 10%의 스푸토리신에 대해 차가운 PBS 1밀리리터를 첨가하여 반응을 담금질합니다. 균일한 용액을 얻기 위해 혼합물을 피펫한다.100 미크론 나일론 세포 여과기를 통해 혼합물을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 40 미크로네 여과기를 통해 여과 단계를 반복한 다음 섭씨 4도에서 300 배 G에서 원심 분리기를 10 분 동안 반복하십시오. 상체를 신선한 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.차가운 PBS의 500 마이크로 리터에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 얼음에 놓습니다. 얼음에 효소를 해동하고 텍스트 원고에 설명된 대로 효소 표준 곡선을 설정합니다. 표준 준비와 병행하여 가래 샘플을 활성화 버퍼에서 희석시.플레이트 판독기에서, NE FRET 프로브 NEmo-1 내지 354 나노미터 및 방출 파장을 기증자를 위한 400 나노미터 및 수용자를 위한 490 나노미터에 대한 여기 파장을 설정한다. CG FRET 프로브 sSam의 경우 공여자용 485나노미터, 수용자용 580나노미터로 발산 파장을 405나노미터로 설정하고 방출을 설정했다. 40 마이크로리터의 샘플, 표준 또는 블랭크를 블랙 96 웰 하프 에어리어 플레이트의 우물에 넣고 마스터 믹스를 추가합니다.플레이트 판독기를 시작하고 기증자에게 60~90초마다 20분 이상 또는 신호의 증가가 고원에 도달할 때까지 기록한다. 각 시간 지점 및 샘플에 대해 기부자 RFU를 수락자 RFU로 나누어 데이터를 내보내고 기부자RFU를 수락비율을 계산합니다. 그런 다음 기증자를 계산하여 수용자 비율 평균 및 표준 편차를 계산합니다.기증자의 선형 성장 내의 경사를 받아수대 비율 변경으로 결정합니다. 각 측정에 대해, 1.5 밀리리터 튜브에서 PBS의 50 마이크로 리터의 부피에서 30, 000 가래 세포를 다시 중단합니다. 가래 세포를 특정 억제제로서, 실온에서 10분 동안 양성 조절으로 적절한 효소를 배양한다.FRET 리포터와 핵 얼룩을 함유한 PBS 50마이크로리터를 각 튜브에 추가하여 최종 농도2마이크로몰러를 얻습니다. 10-20 분 동안 실온에서 혼합물을 배양합니다. 얼음 차가운 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하여 반응을 담금질하고 얼음에 샘플을 배치합니다.세포스핀은 현미경 슬라이드에 혼합물을 스핀. 그런 다음 공기 건조하고 10 분 동안 얼음 차가운 10 %의 메탄올로 세포를 고정합니다. 고정 후, 공기 건조및 적절한 장착 매체와 샘플을 장착.공초점 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 결정적인 통계를 위해 조건당 적어도 100개의 셀을 이미지. 5 밀리리터 FACS 폴리스티렌 라운드 하단 튜브에서 PBS의 100 마이크로 리터에서 1 백만 세포를 다시 중단하고, 얼음에 튜브를 배치합니다.각 샘플에 FC 블록의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 샘플을 배양합니다. 각 튜브를 넣고 어둠 속에서 얼음에 30분 동안 배양합니다.감기 PBS와 원심분리기 의 2 밀리리터로 세포를 300 배 G와 섭씨 4도로 씻어 내보겠습니다. 마지막으로, PBS의 200 마이크로 리터에서 다시 중단. 서스펜션을 각각 100마이크로리터의 2개의 튜브로 나누고 5개의 마이크로리터의 세포 생존성 얼룩을 추가합니다.부정적인 제어 관에 적절한 특정 NSP 억제제를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 샘플을 배양한다. 샘플에 PBS를 추가하고 깨끗한 FACS 튜브에 40 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 기자를 음수 제어 샘플에 넣고 부드럽게 소용돌이를 넣습니다.이 특정 억제제로 인큐베이팅된 세포를 획득하기 시작하고 필요한 경우 기자 PMTs 전압뿐만 아니라 게이트를 약간 조정합니다. 막 바운드 프로테아제 활성으로 인한 비율을 받아들이는 기증자의 변화를 기록하려면 각 튜브에서 1000마리의 호중구를 5~10분마다 기록합니다. 게이트된 실행 가능한 단일 호중구에서 측정된 샘플에 대한 수락자 채널 값으로 기증자를 분할하여 FRET 비율을 계산합니다.100 마이크로몰러 시빌레스타(Sivilestat)로 미리 배양된 호중구의 이미지는 NEmo-2 추가 기자가 추가되기 전에 치료되지 않은 상태로 남겨진 것으로 나타났다. 핵 신호는 그들의 특성에 의해 호중구를 식별하는 데 사용되었고, ROI는 수동으로 선택되었다. 가래 호중구의 비율을 받아들이는 기증자는 플롯되었습니다.각 점은 하나의 ROI의 평균을 나타냅니다. 유동 세포측정제 게이팅은 가래 호중구를 차별하고 연구할 수 있게 합니다. MFI 분포는 리포터 추가 후 0분 과 10분 후에 관찰되었다.1000 개구체 호중구에 대한 평균 기증자 및 수용자 MFI 값을 계산했다. D/A 비율은 초기 증가 후 고원에 도달했습니다. 건강한 기증자 가래 유도는 완벽하기 전에 몇 가지 연습을합니다.휴식과 예상 하기 전에 10~15 분 동안 에어로졸호흡 을 잊지 마십시오. 또한, 항상 가래 세포를 얼음에 보관하고 예상 후 가능한 한 빨리 처리합니다. 우리는 표면 결합 된 protease 활동이 아이들에 있는 초기 폐 손상 및 성인 CF 환자에 있는 폐 질병의 엄격과 상관관계가 있다는 것을 것을을 발견했습니다.따라서 이러한 방법을 함께 사용하면 호중구기도 질환의 초기 염증 바이오마커로서 프로테아제의 탐사를 가능하게 한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 가래 샘플에서 호중구 세린 프로테아제 활성을 정량화하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 분비된 프로테아제를 함유한 샘플은 인식 모티프를 지닌 형광 리포터와 함께 배양됩니다. 프로테아제에 의한 모티프의 절단은 리포터의 공여체 및 수용체 형광단에 의한 개별 형광 방출을 가능하게 하며, 이는 샘플에서 프로테아제 활성을 나타냅니다.

형광 리포터를 사용하여 호중구 세린 프로테아제 활성을 측정하기 위한 In vitro Assay

이 비디오는 마우스 호중구에서 호중구를 자극하여 골수페록시다아제를 함유한 친화성 과립을 방출하는 것과 관련된 흡혈성 과립의 탈과립 분석을 보여줍니다. 후속 효소 반응은 골수과산화효소 수준을 정량화하는 데 사용되어 호중구 활성화에 대한 통찰력을 제공합니다.

An Assay to Monitor Degranulation of Azurophilic Granules in Neutrophils following Activation

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

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비색 분석을 통한 엘라스타제 효소 활성의 조절 정량화

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

배우세요 인간 가래 샘플에서 FRET 프로브와 유세포 분석을 이용한 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활성 정량화 방법. 이 기술은 중성구성 기도 질환의 항염증 치료 평가와 바이오마커 검증에 활용됩니다.

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

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