Name: 双色荧光互相关光谱研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: 学习双色荧光互相关光谱与FRET技术，研究活细胞中G蛋白偶联受体的动态特性与蛋白质相互作用。该方法利用CHO细胞与SNAP标签，为膜受体动力学分析提供可靠的实验方案。

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本项目由德国研究基金会（SFB/TR 240，项目编号 374031971，项目 INF）资助，资助对象为 J. B. 和 K.G.H.。
感谢鲁道夫·菲尔肖中心提供的经费支持以及荧光成像核心单元提供的技术支持。此外，感谢 Ashwin Balakrishnan 对本文的仔细校对。

1. 实验方案
<ol>
	<li>样品制备 
	注意：细胞接种和转染操作需在无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>将一块清洁的盖玻片放入每孔中，置于6孔培养板内，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。 
		注意：盖玻片清洁方案详见补充说明1。</li>
		<li>向每孔加入2 mL含酚红的完全细胞培养基（补充10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），并将培养板暂置一旁。</li>
		<li>在含酚红的相同培养基中，于37 °C和5% CO2条件下培养CHO细胞。用5 mL PBS洗涤细胞以去除死细胞。</li>
		<li>加入2 mL胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育2分钟。</li>
		<li>用含酚红的8 mL培养基稀释已脱落的细胞，并通过移液小心混匀。</li>
		<li>在Neubauer计数板中计数细胞，并以1.5 × 105 个细胞/孔的密度接种至含盖玻片的6孔细胞培养板中（按步骤1.1.1–1.1.2准备）。</li>
		<li>将细胞置于培养箱（37 °C，5% CO2）中培养24小时，使其达到约80%汇合度。</li>
		<li>将2 µg目标载体DNA（例如CT-SNAP或NT-SNAP）和6 µL转染试剂分别加入两个独立的离心管中，每管加入500 µL低血清培养基（对应每孔），于室温（RT）孵育5分钟。</li>
		<li>将两种溶液混合，得到转染混合物，并于室温（RT）孵育20分钟。</li>
		<li>在此期间，用无菌PBS洗涤已接种的CHO细胞一次。</li>
		<li>用不含抗生素的、补充10% FBS的无酚红培养基替换PBS，每孔加入1 mL。</li>
		<li>将全部1 mL转染混合物逐滴加入每孔中，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育细胞。</li>
		<li>为标记SNAP构建体，将适当的SNAP底物储备液稀释于1 mL补充10% FBS的培养基中，使终浓度为1 µM。</li>
		<li>用PBS洗涤转染后的细胞一次，每孔加入1 mL 1 µM SNAP底物溶液。在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。</li>
		<li>用无酚红培养基洗涤细胞三次，每孔加入2 mL无酚红培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。</li>
		<li>将所有样品的盖玻片依次转移至成像室，用500 µL成像缓冲液洗涤。在转移至FRET-FCS系统前，加入500 µL成像缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准测量 
	注意：FRET-FCS系统配备共聚焦显微镜水镜、两条激光线、时间相关单光子计数（TCSPC）系统、两个混合型光电倍增管（PMT）和两个雪崩光电二极管（APD）用于光子采集，以及数据采集软件。每次活细胞测量前必须对系统进行校准，这一点至关重要。系统详细描述见补充说明2。测量过程中，两条激光器及所有探测器（两个PMT和两个APD）始终开启，以确保所有测量在相同条件下进行。进行校准测量时，使用与细胞接种所用盖玻片同一批次的盖玻片，以减少环形校正的变异。
	<ol>
		<li>为调节焦平面、针孔和环形位置，将2 nM绿色校准溶液置于玻璃盖玻片上，开启485 nm和560 nm激光器。激光器以脉冲交错激发（PIE）模式运行16。</li>
		<li>对准溶液焦点，并调节针孔和环形位置，以获得最高计数率和最小共焦体积，从而实现最大分子亮度。</li>
		<li>对10 nM红色校准溶液以及绿色与红色校准溶液的混合液，重复上述过程用于红色通道。</li>
		<li>将10 nM DNA溶液置于玻璃盖玻片上，调节焦点、针孔和环形位置，使绿色与红色检测通道之间的互相关达到最高，即显示最高振幅。 
		注意：步骤1.2.1和1.2.4可能需要反复交替进行，以找到最佳校准状态。在绿色和红色检测通道及共焦重叠体积的焦点、针孔和环形位置优化后，对每种校准溶液进行3–5次、每次30 s–120 s的测量。</li>
		<li>分别对ddH2O、成像培养基和未转染细胞各测量3–5次，每次30 s–120 s，以确定背景计数率。</li>
		<li>采集仪器响应函数，进行3–5次、每次30 s–120 s的测量。此步骤为可选，但强烈建议执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞测量
	<ol>
		<li>通过汞灯照明并经目镜观察，寻找合适的细胞。 
		注意：合适的细胞应为存活状态，表现出相应贴壁细胞系的典型形态。目标蛋白（此处为表面受体）的荧光在整个细胞表面可见。由于FCS检测中分子数量较少时对比度更佳，因此荧光较弱的细胞比强荧光细胞更合适。</li>
		<li>开启两条激光器（PIE模式），通过观察每秒最大计数率对细胞膜进行聚焦。 
		注意：细胞样品的激光功率可能需要降低（物镜处小于5 µW），具体取决于所用荧光团和系统配置。</li>
		<li>在数据采集软件的在线预览中观察eGFP或标记的SNAP-tag（连接至β2AR）的自相关和互相关曲线，采集多个短时测量（约2–10次），每次采集时间为60–180秒。 
		注意：避免长时间连续激发细胞，以防荧光团漂白。但具体测量时长和总测量次数取决于每个细胞的亮度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 数据分析
<ol>
	<li>数据导出
	<ol>
		<li>导出相关曲线，G(tc），以及所有测量的计数率（CR）。</li>
		<li>注意正确定义“prompt”和“delay”时间窗口，并在数据相关软件中使用“microtime gating”选项。 
		注意：总共需要进行三种不同的相关性分析：（1）绿光通道在提示时间窗口内的自相关ACFgp)，（2）延迟时间窗口内红色通道的自相关（ACFrd)，最后（3）将绿色通道在即时时间窗口内的信号与红色通道在延迟时间窗口内的信号进行互相关分析（CCFPIE）。数据导出在不同软件中的操作步骤将逐步展示 补充说明 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准测量
	<ol>
		<li>使用绿色的自相关函数（ACFgp）和红色（ACFrd荧光染料溶液，并根据需要将其拟合到包含额外三重态项的三维扩散模型（公式1），以校准两个所用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小： 
		<img alt="Fluorescence correlation spectroscopy equation, diagram for data analysis in molecular studies." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq01v2.png" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 1"> 公式 1 
		此处， b 是曲线的基线， N 焦点中的分子数量， tD 扩散时间（单位：ms），以及 s = z0/w0 共聚焦体积单元的形状因子。三重态闪烁或其他光物理过程由其幅值描述 aR 弛豫时间 tR. 
		注意：本方案中使用的所有变量和符号均列于表1中。</li>
		<li>使用已知的扩散系数 D 绿色26 红色校准标准27 以及获得的形状因子 s绿色 和 s红色 以确定尺寸（宽度 w0 和高度 z0）和体积 Veff 共聚焦体积单元（公式 2a-c）。 
		<img alt="Static equilibrium equation, \(w_0^2 = 4t_DD\), formula related to mechanical stability analysis." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq02.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 2">     eq. 2a 
		<img alt="z₀ = sw₀ formula, mathematical equation, symbols, algebraic representation" src="/files/ftp_upload/62954/62954eq03.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 3">     eq. 2b 
		<img alt="Equation for effective volume \(V_{\text{eff}} = \pi^{3/2} z_0 w_0^2\), optical analysis." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq04.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 4">     eq. 2c 
		注意：校准参数计算的模板作为补充文件提供（S7）。</li>
		<li>计算光谱串扰 α 绿色荧光信号（在通道0和2中采集）渗入红色检测通道（通道1和3）的背景校正后信号（BG）的比值（公式3）。 
		<img alt="Equation for alpha calculation using color ratios in image analysis methodology." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq05.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 5"> 
		公式 3</li>
		<li>确定受体荧光团的直接激发 δ 通过“prompt”时间窗口（绿色激光激发）与“delay”时间窗口（红色激光激发）中经背景校正的红色校准测量计数率之比，除以供体激发波长（公式4）。 
		<img alt="Transient absorption formula, δ=(CR analysis)*100%; optical studies equation for data calculation." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq06v2.png" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 6"> 
		eq. 4</li>
		<li>计算分子亮度 B 基于背景校正后的计数速率以及测得的聚焦分子数量，对绿色和红色荧光团（eq. 5a-b）进行定量分析。 N，来自三维扩散拟合（公式 1）： 
		<img alt="Mathematical formula for B_green, calculation in statistical analysis, educational research context." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq07.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 7">     eq. 5a 
		<img alt="Equation of biochemical ratio for colorimetric analysis, showing B_red calculation formula." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq08.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 8">     eq. 5b</li>
		<li>安装两者 ACFgp 和 ACFrd 以及 CCFPIE 将双标记DNA的实验数据拟合到三维扩散模型（公式1）。保留所获得的形状因子， s绿色 和 s红色，恒定的 ACFgp 和 ACFrd，分别。该形状因子对于 CCFPIE，sPIE, 通常介于这两个值之间。 
		注意：在理想设置中，两者均 Veff,绿色 和 Veff，红色 将具有相同的大小并完全重叠。</li>
		<li>确定零相关时间处的幅度， G0(tc），根据测得的焦点中表观分子数（N绿色, N红色 和 NPIE).</li>
		<li>计算振幅比 rGR 和 rRG 对于绿色和红色荧光探针完全共扩散的样品（公式6）。请注意 NPIE 不反映焦点中双标记分子的数量，而仅反映1/G0(tc). 
		<img alt="Equation: \( r_{GR} = \frac{G_{0, CCF}(t_c)}{G_{0, ACFqp}(t_c)} \); statistical analysis concept." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq09.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 9">  和  <img alt="Static equilibrium formula, \( \gamma_{RG} = \frac{G_{0,CCF}(t_c)}{G_{0,ACF_{rd}}(t_c)} \), equation." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq10.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 10">     公式 6</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞实验
	<ol>
		<li>对于单标记构建体，将细胞样本拟合到适当的模型中。对于所示的膜受体，扩散表现为双模态形式，具有短扩散时间和长扩散时间。此外，还需考虑荧光团的光物理特性和闪烁行为： 
		<img alt="2D autocorrelation function formula for fluorescence correlation spectroscopy analysis." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq011v2.png" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 11"> 公式 7 
		此处， td1 和 td2 是所需的两个扩散时间，以及 a1 是第一次扩散时间的分数。 
		注意：与校准测量中游离染料和DNA链在各个方向自由扩散不同，膜受体仅沿细胞膜进行二维扩散。这种三维与二维扩散的差异体现在修正后的扩散项中（见公式1），其中 tD 在二维情况下，不依赖于形状因子 s 共聚焦体积单元</li>
		<li>计算浓度 c 绿色或红色标记蛋白分别来自 N 和 Veff 使用基础数学（公式 8）： 
		<img alt="Concentration formula C=N/(VeffNA), chemical analysis calculation, equation for molarity." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq12.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 12">     eq. 8 
		其中 NA 阿伏伽德罗常数</li>
		<li>对于N端SNAP标记和细胞内eGFP，拟合两个自相关曲线（ACFgp 和 ACFrd使用与单标记构建体相同的模型对双标记样品的ACF（公式7）进行拟合 CCFPIE 使用双峰扩散模型（公式 9）： 
		<img alt="2D correlation function formula, displaying static equilibrium and data fitting in spectroscopy analysis." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq13.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 13">      公式 9 
		注意：为了对系统进行全局描述，必须同时拟合所有三条曲线：三条曲线的扩散项相同，唯一区别在于弛豫项 CCFPIE由于两种荧光团的光物理过程通常互不相关，因此无需引入关联项。这种弛豫项的缺失导致了平坦的 CCFPIE 在较短的关联时间内。然而，由于供体荧光团引起的受体串扰和直接激发可能导致假阳性信号强度，应通过校准测量仔细检查。</li>
		<li>计算浓度 c 绿色或红色标记蛋白的 N 和 Veff 使用公式8。</li>
		<li>估算组分或浓度， cGR 或 cRG，利用从DNA样本获得的校正因子，对细胞样本中相互作用的绿色和红色标记蛋白进行校正后的振幅比值 rGR 和 rRG 细胞样品及其各自获得的浓度（公式10）。 
		<img alt="Chromatic adaptation equation cGR=rGR·cgreen for colorimetry analysis and calibration." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq14.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 14"> 和 <img alt="Equation illustrating color transformation; formula: c_RG = γ_RG × c_red." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq15.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 15">     公式 10</li>
		<li>对于C端SNAP标签和细胞内eGFP，拟合两个自相关曲线（ACFgp 和 ACFrdFRET 样品的浓度与单标记样品相同（公式 7），并且 CCFFRET 到一个包含反相关项的双峰扩散模型（方程 11） 
		<img alt="2D cross-correlation equation for data analysis, diagram illustrating symbol G_CCF,2D(t_c)." src="/files/ftp_upload/62954/62954eq016v2.png" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation 16"> eq. 11 
		其中 af 反映总反相关性的幅度 aR 和 tR 相应的振幅和弛豫时间。 
		注意：由于FRET导致荧光变化呈反相关时，可能需要一个或多个反相关项（公式11），从而产生一个“凹陷” CCFFRET 在相关时间较短时，伴随两个自相关函数的上升ACFgp 和 腺瘤性结肠息肉病灶rd然而，需要注意的是，三重态闪烁等光物理效应可能会通过抑制FRET诱导的反相关项而掩盖该信号。结合使用滤波FCS方法的联合分析可能有助于揭示反相关项。此外，应排除由计数电子设备在纳秒量级死时间引起的技术伪影16. 在ChiSurf中执行该分析的更详细逐步操作流程28 共聚焦体积或分子亮度计算的模板可在 Github 代码库（https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS）及补充文件中获取补充说明 4 和 补充说明 6此外，用于批量导出使用 Symphotime 软件获取的 .ptu 格式数据的 Python 脚本也可在该处找到。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在活细胞中，FCS 技术可用于评估 G 蛋白偶联受体（GPCR）的受体运动性及其相互作用41。FRET-FCS 技术的优势在于，除了研究受体的运动性外，还可探究 GPCR 的构象动态。然而，在活细胞中实施 FRET-FCS 实验具有挑战性，需要满足以下条件：目标荧光标记蛋白的表达水平较低（或最多为中等水平）、实验装置经过良好校准，以及具备高效的数据分析流程。本文首先从生物学、光谱学和技术角度，讨论了样品制备和实验操作中的关键要点。
关键的实验步骤包括尽量减少背景信号和自发荧光（通过使用经过充分清洗的盖玻片和酚红-free培养基）、优化转染条件（例如质粒DNA用量及转染后时间），以实现低表达水平和高效标记。当然，确保标记蛋白的功能未受影响也至关重要。因此，在活细胞实验中，标记策略和标记位点的选择通常倾向于将荧光蛋白或SNAP/CLIP标签连接至蛋白灵活的N端或C端42，43。近年来，一些替代性标记策略也逐渐出现，例如插入带有可反应侧链的非天然氨基酸，用于与有机荧光染料进行标记44。
对于双色 PIE-FCS 实验，当仅需研究两种目标分子之间的相互作用时，荧光染料可从多种成熟的荧光蛋白或 SNAP/CLIP 底物中进行选择。从光谱学角度出发，应选择一对荧光染料，使其产生尽可能少的串扰或直接受体激发。此外，所选荧光染料应具备良好的光稳定性，在选定的实验条件下应表现出轻微或无光漂白现象。建议优先选择红色光谱范围内的荧光染料，原因如下：（1）细胞自身的自发荧光背景较低；（2）激发光波长较长，因而光毒性更小14。可通过首先进行所谓的“功率梯度实验”来最小化光漂白，即逐步增加激光功率并观察分子亮度变化。最佳激发光强度范围应位于该实验结果的线性区间内45。
如果两个荧光标签还需通过FRET报告蛋白质的构象动态，则可用荧光染料的选择将更为受限。此时，应事先根据已有结构或分子尺寸估算两个荧光染料之间可能的最小/最大距离，并选择具有合适Förster半径R0的荧光染料组合，以确保FRET能够实际发生20。
此处选择 eGFP 和 SNAP 标签用于标记，SNAP 标签使用细胞内或细胞膜不通透的表面底物进行标记。其光谱与图 2C-D所示相似。该荧光团组合在红光检测通道中表现出明显的 eGFP 串扰，以及在即时时间窗口内，绿色激发光对 SNAP 底物受体的直接激发，导致在即时时间窗口内红光通道中出现显著的“假”信号。理想情况下，串扰和受体直接激发这两个值均不应超过 5%5,6,38。然而，由于其 Förster 半径为 57 Å，非常适合用于探测 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 构建体中标签之间的距离，这一点可通过淬灭的 eGFP 寿命进行评估（补充说明 5）。
从技术上讲，与任何荧光光谱实验一样，仪器应经过良好校准，并配备合适的激发光源、发射滤光片和高灵敏度探测器。为避免探测器后脉冲引起的伪影 &#181;在时间尺度上，每种颜色至少应有两个检测器，以便进行互相关分析。在现代时间相关单光子计数电子系统中，由于具有独立的信号路由通道，检测卡在纳秒时间范围内的死时间几乎不起作用，但可根据Müller提出的方法进行检查。 等人 16 提供的感兴趣时间范围位于亚微秒至微秒量级&#181;s/ns 时间范围。此外，为了在 ps 时间范围内实现更高的时间分辨率，应将每个检测通道加倍，即每种颜色使用四个检测器，以避免探测器的死时间2,15,29,46. 尽管平均荧光寿命可通过非偏振荧光检测进行估算，但在分析荧光团之间距离（~分布）时，必须收集偏振相关的发射信号。这是因为FRET中的能量转移效率依赖于两个荧光团的空间取向。更多详细信息参见此处20,28,47最后，在 PIE 实验中，激发脉冲与延迟脉冲之间的间隔至关重要，应选择合适的间隔，使得荧光团的荧光强度已基本衰减图1B）。一个通用的规则是将两个脉冲间隔设置为荧光寿命的5倍，即对于荧光寿命为2.5 ns的eGFP，最小间隔应为12.5 ns。22.
在详细阐述实验流程的所有注意事项后，接下来将更深入地讨论数据及其分析。如方案部分所述，必须每天检查仪器的准直情况，包括校准测量结果的分析。例如，图2A-C 所示数据在8-40 µs范围内显示出一个额外的弛豫组分。绿色校准荧光团典型的三重态闪烁通常出现在2-10 µs范围内13,15,48。而DNA样品所有曲线中均需引入的较慢弛豫组分（图3C），其速度远慢于实际的三重态闪烁，可能源于DNA与荧光团之间的相互作用39。然而，该组分在CCFPIE中不应出现，因此极有可能来源于残余的串扰信号。因此，强烈建议在开展细胞实验前立即分析校准样品，以评估当日仪器准直的质量。
正确的共聚焦重叠体积校准需要使用绿色和红色标记完全共扩散的样品。此处使用荧光标记的双链DNA。两条DNA链均可设计为在特定距离处带有所需的荧光团。设计好的单链可经退火形成双链，产率较高。然而，良好实验室规范建议通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA链的完整性及标记程度，并通过吸收光谱测量验证双链组装的产率，因为该校准测量的关键前提是绿色与红色标记之间存在100%的共扩散。若此前提不成立，则可能需要引入校正因子16,22。在图2和图3所示的校准测量中，绿色和红色通道的检测体积分别为1.4 fL和1.9 fL。对于接近衍射极限激发体积的光路系统，该体积差异是预期结果（补充说明2）。在此条件下，激发体积的大小与激发波长成正比，这也解释了图3B中观察到的不同关联幅度。由此得出的校正因子rGR = 0.56 和 rRG = 0.72，用于校正该体积差异以及两个激发体积之间可能存在的非完全重叠3,4。
图 4、图 5、图 6 和&#160;图 7 展示了一项基于 PIE-F(C)CS 研究构象蛋白动态的工作流程。首先，两种单标记构建体 β2AR-IL3-eGFP 和 NT-SNAP-β2AR 作为对照，用于在无另一种荧光团存在的情况下表征细胞中荧光团的性质（图 4）。接着，双标记构建体 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 携带一个朝向细胞外侧的 SNAP 标签和一个位于胞质侧的 eGFP，作为“100% 共扩散”的对照（图 5）。最后一个构建体 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 在胞质侧同时携带两个荧光团，且彼此足够接近，可发生 FRET。在此情况下，预期会出现 100% 的共扩散，同时在绿色和红色通道的即时时间窗口中（即供体激发后）出现强度波动的反相关信号，这是由于蛋白动态影响了 FRET 效率31,32,33。这种动态可能在 CCFFRET 中表现为反相关（图 6-7）。
所有 GPCR β2AR 构建体在细胞膜上均表现出双峰扩散行为（图 4A）。β2AR-IL3-eGFP 仅显示出预期的三重闪烁现象（图 5B）13,15，而 NT-SNAP-β2AR 则额外表现出一个较慢的弛豫时间（图 5C-D）。该弛豫时间 tR2 可能源于未结合的 SNAP 底物。这一问题可通过进一步实验加以阐明，例如测量所用 SNAP 底物在水溶液中的扩散与光物理特性。值得注意的是，区分扩散时间与弛豫时间的一个直接实验方法是改变共聚焦系统的针孔尺寸，即增大有效检测体积：随着有效体积的增加，扩散时间会相应延长，而弛豫项则保持不变13。在根据拟合结果确定荧光蛋白（FP）浓度时，需注意荧光蛋白通常经历一个成熟过程，最终形成发色团12。该成熟时间因不同荧光蛋白而异，且其光物理特性还受局部化学环境的影响13,15。因此，FCS 报告的样品中实际蛋白浓度通常被低估；若实验中可确定非荧光荧光蛋白的比例，则可对此进行校正。最后，建议在活细胞中检测荧光团的光谱，必要时对 α 和 δ 的值进行校正，因为大多数荧光团对其环境高度敏感13,15,48。背景信号应通过未转染细胞中采集的信号来确定。此外，应检查相应另一颜色通道的自相关曲线以及 CCFPIE，以便识别假信号（补充说明 4 - 图 30）。
来自 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 的两次测量结果（图 5D），其中荧光团位于膜的两侧，分别在不同日期采集，体现了在时间分辨的单分子荧光研究中统计学的重要性。此处不同的结果可能源于标记程度的差异：在一个细胞中，较高的标记效率和多次测量的平均处理使得噪声相对较低（图 5B）；而在另一个细胞中，仅能采集到两次测量数据（图 5A）。除了收集足够数量的数据外，及时评估结果并可能优化标记策略也至关重要。在设计实验时，需牢记 FRET 虽然灵敏，但仅对不超过 10 nm 的距离有响应，超出此范围则“无感知”。在本例中，这种“无感知”表现为 eGFP 荧光寿命未发生改变（补充说明 5）。在 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 构建体中（图 6A），可通过 eGFP 寿命的淬灭明确检测到 FRET 的存在（补充说明 5）。然而，并未观察到反相关项（图 6B），这意味着 FRET 要么未发生波动，要么其变化时间尺度慢于扩散时间。在 ACFgp、ACFrp、ACFrd 和 CCFFRET 中，最多需要引入三个额外的弛豫项（图 6C）。ACFrp、ACFrd 和 CCFFRET 中的慢组分可能源于受体荧光团的漂白，这自然会影响这些曲线中测得的慢扩散时间值（约 350 ms，而 ACFgp 中为 117 ms）。由于共聚焦体积的差异，红色通道中的 tD 应略大于绿色通道（图 2），但差异仅与体积大小的差异相当。3 µs 的极快弛豫时间反映了荧光团的三重态闪烁行为13,15,48，而 37 µs 的较慢弛豫时间可能源于 FRET：类似于 FRET 在 CCFFRET 中引起反相关，预期在自相关曲线中会出现正相关31,32,33。该组分在 CCFFRET 中表现为“正”相关，并出现在 ACFrd 中，可能与较高的串扰有关，尚需进一步阐明。请注意，CCFPIE 在短相关时间下呈平坦状，符合预期。
另一方面，需要注意的是，所研究体系中发生FRET会导致相关曲线出现非线性效应6。例如，分子的亮度与相关幅度的平方成正比，而每种FRET状态（以及始终存在的无活性受体分子）均表现出不同的分子亮度。事实上，FRET会降低检测到的绿色分子表观浓度（即增加ACFgp幅度），同时高估红色分子的数量（由红光直接检测确定）5。这两种效应均会影响从CCFFRET和CCFPIE中推导出的相互作用程度。然而，全局分析方法——例如用于研究钙调蛋白31,32或突触融合蛋白33的分子内动力学——可以揭示蛋白质的动力学行为。在经过仔细校准后，可从相对的CCFPIE与ACF幅度中提取平均FRET效率22，而极限状态则可通过供体荧光寿命分布的分析来确定33。
考虑到在使用eGFP等大荧光团的活细胞实验中，FRET对比度可能比图6所示模拟中的假设值更低，且模拟中未加入受体的直接激发，这或许可以解释为何在活细胞实验中识别反相关信号极具挑战性。一种有前景的分析替代方法依赖于利用时间相关单光子计数数据采集所获得的光子到达时间直方图（图1B）中编码的信息29,30。如果样品内两种（或多种）（FRET）组分的荧光寿命（~模式）已知（图7A），则可在相关分析过程中应用相应的“滤波器”或权重（图7B）17,18,19。由此获得的相关曲线不再代表检测通道之间的自相关或互相关，而是代表两种不同（FRET）组分之间的自相关或互相关，因此被重新命名为组分自相关函数（sACF）或组分互相关函数（sCCF）。将该方法应用于具有中等FRET对比度、高串扰和三重态闪烁的模拟数据时，能够恢复出反相关项（图7C-D）。然而需要注意的是，虽然可以获得弛豫时间，但其与振幅之间的关系已丢失18。该方法此前已在活细胞实验中应用，例如用于研究EGFR与其拮抗剂之间的相互作用49，或用于区分与具有异常短和长荧光寿命eGFP变体结合的蛋白质所发出的荧光50。
尽管基于PIE的FRET测量已广泛用于研究纯化蛋白质的动态特性36 22，但在活细胞中，该方法主要用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该技术已被应用于研究酵母中MAP激酶活性的调控51，或解析膜蛋白与其胞质结合伴侣之间的相互作用，如近期一篇综述文章所总结52。在此过程中，若绿色荧光团在红色通道的延迟时间窗口内仍存在显著串扰，或红色信号在绿色通道的即时时间窗口内出现，则可能引发问题。前者可能是由于红色脉冲相对于绿色脉冲的延迟不足所致，而这两种效应均源于所选荧光团的激发和发射光谱重叠度过高。建议仔细检查相应的单标记构建体，并校正假阳性CCFPIE幅度，尤其是在细胞中，具有极短荧光寿命的自发荧光可能成为另一个复杂因素22。
总之，本文所述的FRET-FCS方法在接近生理浓度条件下研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学方面具有巨大潜力。本方案重点介绍了活细胞测量过程中所需的校准步骤以及必要的定量分析。为此，展示了多种活细胞测量结果，并结合了模拟分析。通过可系统调节参数的定制化拟合模型来描述特定数据的运动特性及光物理性质，模拟有助于深入理解实验现象。分析过程采用开源软件工具，并配有详尽的分步操作指南和易于调整的模板。最终，随着技术进步，即即插即用型PIE-FCS系统的商品化供应，以及开源数据分析软件的普及，该技术将日益为更广泛的研究群体所采用，从而以最高灵敏度揭示活细胞中蛋白质相互作用与动力学行为。

荧光光谱法是定量研究蛋白质动态和蛋白质-蛋白质相互作用的主要方法之一，可在细胞环境中以最小干扰实现检测。共聚焦荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的分子动力学分析方法，具有单分子灵敏度高、选择性强以及适用于活细胞等优点1。与其他以动力学为导向的&#160;方法相比，FCS可测量的时间范围更广，从约纳秒（ns）到约&#160;秒（s），尤其覆盖了基于成像的方法通常难以触及的快速时间尺度。此外，FCS还具备空间选择性，可轻松区分细胞膜、细胞质和细胞核内的分子动力学行为2。因此，利用FCS可对分子闪烁、局部平均浓度以及扩散系数进行定量分析。在双色检测模式下，通过荧光互相关光谱法（FCCS）分析两种分子物种的共扩散行为，可便捷地研究分子间动力学过程，例如分子结合事件3,4,5。
相关光谱学的基本原理是对荧光标记的生物分子在激光焦点内扩散进出时所产生的强度波动进行统计分析（图1A）。由此得到的自相关或互相关函数可通过曲线拟合进一步分析，最终获得感兴趣的动力学速率常数。换言之，FCS和FCCS这类统计方法并不像单颗粒追踪那样提供单个分子的运动轨迹，而是以高时间分辨率揭示被测样品的动态模式或&#34;指纹&#34;。当与 Förster 共振能量转移（FRET）结合时，可在共聚焦显微镜系统中同时监测分子内动力学过程，例如构象变化5,6。FRET 可探测两个荧光团之间的距离，常被称为分子&#34;纳米尺&#34;。能量转移仅在以下条件下发生：分子间距离非常接近（&#60; 10 nm）、供体的发射光谱与受体分子的吸收光谱有显著重叠，且供体与受体的偶极取向（足够）平行。因此，FRET 与 FCCS 的结合提供了一种具有极高时空分辨率的技术。当需要空间选择性、高灵敏度以及活细胞兼容性时，FRET-FCCS 在测量蛋白质动力学与相互作用方面明显优于等温滴定 calorimetry（ITC）7、表面等离子体共振（SPR）8 或核磁共振（NMR）9,10 等其他方法。
尽管双色荧光互相关光谱技术（dc-FCCS）具有强大的功能和广阔的应用前景，但由于检测通道之间存在光谱渗漏或串扰3,4、不同激光谱线导致共焦体积差异3,4,11、背景信号、样品的噪声或光稳定性有限12,13,14,15等因素，使得在活细胞中实施dc-FCCS在技术上仍具挑战性。将脉冲交错激发（PIE）引入FCCS是一项重要的改进，通过在时间上分离不同激光激发，有效降低通道间的光谱串扰16。此外，针对光谱渗漏17,18,19和背景信号的其他校正方法也已被广泛接受17,18,19。有关FCS、PIE或FRET的详细内容及基本原理，读者可参考以下文献2,4,6,16,20,21,22,23,24。
此处，提供了所有必要的校准实验与分析，以及一种原型G蛋白偶联受体β2-肾上腺素能受体（β2AR），针对三种不同情景的结果如下：（1）单标记分子，携带 either a &#34;绿色&#34; （eGFP）或一个 &#34;红色&#34; （基于SNAP标签的标记）25 荧光团；（2）双标记构建体，其带有N端SNAP标签和细胞内eGFP（NT-SNAP）［在此情况下，两个标记位于同一蛋白质上，因此预期共扩散率为100%］&#160;以及（3）双标记样本，其中两种荧光团位于细胞膜的同一侧（CT-SNAP），该样本带有C端SNAP标签和细胞内eGFP。此处两种标记仍位于同一蛋白上，预期同样具有100%的共扩散。由于两种标记彼此非常接近，且位于细胞膜的同一侧，因此具备观察到FRET及反相关行为的潜力。所有构建体均转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，并随后用一种膜非通透性的红色荧光底物进行标记，该底物适用于NT-SNAP构建体&#160;膜通透性适用于CT-SNAP构建体。最后，模拟数据展示了实验参数对FRET诱导的反相关性的影响，以及蛋白质-蛋白质相互作用对共扩散幅度的影响。
因此，本方案提供了在活细胞中进行FRET-FCCS联用实验的完整指南，旨在研究蛋白质动态及蛋白质-蛋白质相互作用，同时阐明可能存在的技术/物理伪影、面临的挑战以及相应的解决方案。

<table><tbody><tr><td>1× 4f 配置望远镜，包含五片透镜</td><td>Qioptiq，雷尔，英国</td><td>G063126000</td><td>光学</td></tr><tr><td>2x 带通滤光片 Brightline</td><td>AHF, T&amp;uuml;德国宾根</td><td>HC 525/50 和 HC 600/52</td><td>筛选</td></tr><tr><td>2x 二向色分光镜</td><td>AHF, T&amp;uuml;德国比ingen</td><td>HC BS F38-573</td><td>筛选</td></tr><tr><td>Nunc 6孔培养板</td><td>Thermo Scientific（美国瓦尔瑟姆）</td><td>140675</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS 酯（绿色校准标准）</td><td>Invitrogen，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）</td><td>A20000</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 NHS 酯（红色校准标准）</td><td>Invitrogen，Life Technologies（Carlsbad，美国）</td><td>A20003</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ASI载物台PZ-2000 XYZ</td><td>Visitron Systems GmbH，Puchheim，德国</td><td>WK-XYB-PZ-IX71</td><td>显微镜部件</td></tr><tr><td>Attofluor细胞培养皿，35 mm直径，用于&amp;nbsp; 25 mm圆形盖玻片</td><td>Invitrogen，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）</td><td>A7816</td><td>玻璃盖玻片夹持器</td></tr><tr><td>雪崩光电二极管 Perkin Elmer（SPCM-AQR-14）</td><td>Laser Components GmbH，Olching，德国</td><td>SPCM-AQR-14</td><td>单光子计数探测器</td></tr><tr><td>分光镜</td><td>纽波特，达姆施塔特，德国</td><td>10FC16PB.3</td><td>筛选</td></tr><tr><td>BioRender（软件）</td><td>Science Suite Inc - o/a BioRender（多伦多，加拿大）</td><td>---</td><td>用于创建 GPCR 示意图的软件，https://app.biorender.com/</td></tr><tr><td>中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>ChiSurf（数据分析软件）</td><td>Thomas-Otavio Peulen，美国加利福尼亚大学旧金山分校生物工程与治疗科学系</td><td>---</td><td>基于 tttrlib 的软件，用于分析荧光相关数据和荧光衰减直方图，https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf&lt;br/&gt; 教程：https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&amp;&；t=2秒&lt;br/&gt; 参考文献：Peulen 等. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>472476-2.5L</td><td>试剂</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH（德国达姆施塔特）</td><td>A3672,0250</td><td>试剂</td></tr><tr><td>DNA链（40 bp荧光团间距）</td><td>IBA Lifesciences GmbH (G&amp;ouml;德国哥廷根</td><td>---</td><td>试剂，5&amp;rsquo; CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3&amp;rsquo;, 3&amp;rsquo; GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基：营养混合物 F12（含酚红与不含酚红）</td><td>GIBCO，Life Technologies（Carlsbad，美国）</td><td>P04-41250, P04-41650</td><td>试剂</td></tr><tr><td>乙醇（纯）</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>34852-1L-M</td><td>试剂</td></tr><tr><td>赤藓红B，染料含量 &gt;=95 %</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>200964-5G</td><td>试剂、仪器响应函数，用乙醇溶解至 10 mg/mL</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biochrom&amp;nbsp; （德国柏林）</td><td>S 0615</td><td>试剂</td></tr><tr><td>荧光光源 X-Cite 120 Q</td><td>Excelitas Technologies，加拿大安大略省</td><td>XI120-Q-5060</td><td>显微镜部件</td></tr><tr><td>荧光 SNAP-底物细胞：SNAP Cell TMR-STAR</td><td>New England BioLabs（德国美因河畔法兰克福）</td><td>S9105S</td><td>试剂</td></tr><tr><td>荧光 SNAP-底物表面：DY-549</td><td>德国法兰克福美因河畔新英格兰生物实验室（New England BioLabs）</td><td>S9112S</td><td>试剂</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（尺寸：直径 24 mm，厚度 0.13 - 0.16 mm）</td><td>马里恩费尔德-苏佩里奥（劳达-科&amp;ouml;nigshofen，德国</td><td>111640</td><td>试剂</td></tr><tr><td>激光控制器</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>910020（PDL 828-S） &quot;SEPIA II&quot;)</td><td>光学</td></tr><tr><td>激光线（480 nm 和 560 nm）</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>912485 (LDH-D-C-485)，912561 (LDH-D-TA-560)</td><td>光学</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen，Life Technologies（美国卡尔尔斯巴德）</td><td>11668-019</td><td>试剂</td></tr><tr><td>MFD suite（软件）</td><td>AG Seidel，德国杜塞尔多夫海因里希-海涅大学</td><td>---</td><td>用于单分子荧光实验分析的软件包，包括例如 Kristine（tttr 数据相关性分析）、Burbulator（单分子实验模拟），https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-packagе-for-mfd-fcs-and-mfis</td></tr><tr><td>消色差双胶合透镜，增透膜：400-700 nm，焦距 f=150 mm，直径 D=25.4 mm</td><td>Thorlabs，德国贝尔格基兴</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>扩束器的第二部分</td></tr><tr><td>血细胞计数板（深度 0.1 mm）</td><td>Marienfeld-Superior (Lauda-K&amp;ouml;nigshofen, 德国</td><td>640110</td><td>试剂</td></tr><tr><td>奥林巴斯 IX 71 显微镜平台</td><td>Olympus，德国汉堡</td><td>IX2-ILL100</td><td>显微镜部件</td></tr><tr><td>Opti-MEM（减血清培养基）</td><td>GIBCO，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）</td><td>31985-047</td><td>试剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）</td><td>049M4857V</td><td>试剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GIBCO，Life Technologies（美国卡尔兹巴德）</td><td>14190144</td><td>试剂</td></tr><tr><td>针孔（50 &amp;micro;M)</td><td>德国达姆施塔特纽波特</td><td>PNH-50</td><td>针孔</td></tr><tr><td>PMT Hybrid-40</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>932200（PMA Hybrid 40）</td><td>单光子计数探测器</td></tr><tr><td>Python 脚本（软件）</td><td>Katherina Hemmen，德国维尔茨堡大学整合与转化影像鲁道夫-菲尔肖中心</td><td>---</td><td>基于 tttrlib（https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib）编写的一系列 Python 自定义脚本，用于（1）确定平均计数率，（2）对数据进行关联分析，以及（3）构建荧光衰减直方图，https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS</td></tr><tr><td>四通道二向色镜（zt405/473-488/561/640 rpc 相位 r uf1）</td><td>AHF, T&amp;uuml;德国宾根</td><td>F73-421PH</td><td>筛选</td></tr><tr><td>单模光纤偏振保持，数值孔径 = 0.08，带准直器</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>02126</td><td>光学</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>卡尔·罗斯特（德国卡尔斯鲁厄）</td><td>6771.1</td><td>试剂</td></tr><tr><td>SymPhotime x64 软件（数据采集与数据导出软件）</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>931073（SPT64-1+2 单用户）</td><td>在自主搭建的FCCS系统上进行时间标记时间分辨（tttr）数据采集，数据导出</td></tr><tr><td>时间相关单光子计数（TCSPC）系统 Hydraharp 400</td><td>Picoquant，德国柏林</td><td>930010（Hydraharp 400）</td><td>光学</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>T4299-100ml</td><td>试剂</td></tr><tr><td>未安装消色差双合透镜，增透膜：400 - 700 nm，直径=12.7 mm，焦距=-20 mm</td><td>Thorlabs，德国贝尔格基兴</td><td>ACN127-020-A</td><td>扩束器的第一部分</td></tr><tr><td>水浸物镜（UPlanSApo 60x/1.20 W）</td><td>Olympus，德国汉堡</td><td>UPLSAPO60XW</td><td>目标</td></tr></tbody></table>

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

我们提出了一种结合荧光共振能量转移（FRET）的活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）实验方案与工作流程，利用现代荧光标记技术研究活细胞中膜受体的动力学行为。在双色FCCS中，荧光强度的波动反映了分子的动态过程 &#34;指纹&#34; 通过检测相应荧光生物分子的共扩散或受体结合情况。FRET 因其对分子间距离的高度敏感性，是一种广为人知的 &#34;纳米标尺&#34; 以监测分子内变化。综上所述，构象变化以及局部受体浓度和迁移率常数等关键参数可在细胞环境中被检测。
由于细胞中噪声水平较高且样本易受损伤，定量荧光方法在细胞中的应用具有挑战性。本文展示了如何开展该实验，包括使用双色标记进行校准的步骤 β2-肾上腺素能受体（β2AR）用 eGFP 和 SNAP-tag-TAMRA 标记。提供了一套使用开源软件和模板的逐步数据分析流程，易于定制。
我们的指南使研究人员能够解析活细胞中生物分子的分子相互作用 原位 尽管活细胞实验中的信噪比较低，仍具有高可靠性。FRET尤其是FCCS在低浓度下的工作窗口允许在接近生理条件下进行定量分析。

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。

我们介绍了一种用于活细胞双色荧光交叉相关光谱（FCCS）结合Förster共振...的实验方案与工作流程

荧光交叉相关光谱是一种统计学方法，利用时间分辨荧光来精确定位活细胞中G蛋白偶联受体的动态特征。本文特别关注β-2肾上腺素能受体。鞘脂类受体主要提供有关平移扩散动力学的信息，结合荧光各向异性，还可获得旋转扩散信息。通过引入额外的标记，我们还可以探测标记之间是否促进共振能量转移，从而判断是否存在促进结合或甚至构象变化的情况。定量的时间分辨荧光实验需要精确调整装置并进行校准测量。在接下来的几分钟内，我们将提供一份实验指南，介绍如何利用可克隆标签和合成荧光染料，对G蛋白偶联受体进行活细胞荧光相关光谱、交叉相关光谱以及福斯特共振能量转移研究。细胞静置和固定操作需在无菌条件下进行。将洁净的盖玻片哑铃状载体放入六孔培养板中，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗，随后向每孔加入2 mL含酚红的细胞培养基，培养基中需补充10%胎牛血清、100 微克/毫升青霉素和100 微克/毫升链霉素，并暂时放置备用。取在含酚红的相同培养基中、37摄氏度、5% CO2条件下培养的CHO细胞，用5 mL PBS洗涤以去除死细胞。加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育 2 分钟。用 8 mL 含酚红的培养基稀释数据细胞，并通过移液小心混匀。在 Neubauer 计数板中对细胞进行计数，并以每孔 150,000 个细胞的密度将细胞接种于六孔培养板中含盖玻片的孔内。将细胞置于培养箱中培养24小时，使其融合度达到约80%。将两微克目的载体DNA（例如CT SNAP或NT SNAP）和六微升转染试剂分别加入两个独立的离心管中。每个孔中加入500 µL含减血清培养基，于室温孵育5分钟。将两种溶液混合，得到转染混合物，并在室温下继续孵育20分钟。在此期间，用无菌PBS洗涤贴壁的CHO细胞一次。用每孔 1 ml 不含酚红的培养基替换 PBS，培养基中添加 10% 胎牛血清，不加抗生素。将 1 ml 构建混合物逐滴加入每孔中，于含 5% CO2 的 37 摄氏度条件下孵育细胞过夜。用于标记时，将适量的 SNAP 底物稀释于 1 mL 添加了 10% 胎牛血清的培养基中，使终浓度为 1 µM。用 PBS 清洗转染的细胞一次，每孔加入 1 mL 1 微摩尔的 SNAP 底物溶液。在 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育细胞 20 分钟。用不含酚红的培养基清洗细胞三次，每孔加入 2 mL 不含酚红的培养基。将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育30分钟。随后将所有样品的盖玻片转移至成像室中，并用500 µL成像缓冲液洗涤。在转移至FRED FCS系统前，加入500 µL成像缓冲液。FRED FCS 装置配备了一个共聚焦显微镜水镜物镜、两条激光线、一个时间门控单分子荧光计数系统、两个混合型 BMT 以及两个用于光子采集的探测器，同时还配有数据采集软件。每次在活细胞中进行测量前，对装置进行校准至关重要。为调节焦距、针孔及光路位置，需将两纳米浓度的绿色校准溶液滴加在玻璃盖玻片上，并开启485纳米和560纳米激光器，使其以堆叠式交错激发（PI模式）运行。聚焦于溶液，并调整针孔和环形圈的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，从而得到最大的分子亮度。使用10纳摩尔的红色校准溶液以及两种溶液的混合物，对红色通道重复此过程。将10纳摩尔的DNA溶液置于玻璃盖玻片上，调整针孔的焦平面和环形圈的位置，使绿色和红色检测通道之间的交叉信号达到最强。该信号具有最高的振幅。在活细胞中进行测量时，通过使用指示灯标记并经由目镜观察，找到一个合适的细胞。在PI模式下打开两台激光器，并通过寻找每秒最大计数来聚焦于细胞膜。请注意，细胞样品可能需要降低激光功率，物镜处最好低于五微瓦。这在很大程度上取决于所使用的荧光染料和实验装置。在数据采集软件的在线预览中观察结合了EGP和Snap标签探针的β-2肾上腺素受体的自相关和互相关曲线，并采集多个分选测量数据，每个测量的采集时间介于60至180秒之间。导出所有测量的相关曲线和对比度数据。请注意正确定义脉冲和延迟时间窗口，并在数据相关软件中使用微时间获取选项。总共需要三种不同的相关性分析：绿色通道即时时间窗口的自相关，红色通道的自相关，以及延迟时间窗口的自相关。最后，绿色通道信号与延迟时间窗口中的红色通道信号进行了互相关分析。此处展示了绿色和红色荧光信号在溶液中的自相关函数，并将其拟合至一个包含三重态项的三维扩散模型，以校准两种颜色通道下共聚焦检测体积的形状和大小。其中，B 为曲线的基线，表示焦点处的分子数；TD 为扩散时间；S 为零点处横向与轴向半径之比（ω₀），即共聚焦体积单元的形状因子。三重态闪烁及光物理过程由振幅 AR 和弛豫时间 TR 描述。利用已知的绿色和红色校准样品的扩散系数，获得形状因子，从而确定有效共聚焦体积单元的尺寸与体积。通过计算类似IFR的光谱，将通道零和通道二收集到的绿色荧光信号与在正确检测通道（通道一和通道三）中收集到的背景信号的比值进行分析。通过供体激发波长下受体信号的直接预期值，结合红色校准测量中背景校正对比度的比值，以及绿色激光在即时时间窗口激发与红色激光在延迟时间窗口激发下获得的背景校正信号，确定数据的受体流动特性。基于背景校正对比度，计算绿色和红色通道中的分子亮度B，并由此获得分子数量，进而对3D扩散拟合进行分析。将绿色和红色通道的自相关，以及双标记DNA的绿色激发光与红色延迟光之间的互相关，同时拟合到3D扩散模型中，并保持自相关函数的形状因子恒定。互相关函数的形状因子通常介于这两个值之间。根据表观分子数和聚焦参数的拟合值，确定零相关时间处的振幅。计算样品中绿色和红色膜张力完全共扩散（100%共扩散）的振幅比。将细胞样品拟合到适当的模型中。结果显示膜受体扩散在短时间扩散而非长时间扩散时，并不呈现双峰分布特征。此外，还需要考虑光物理特性以及基底力导致的闪烁现象。其中，TD1 和 TD2 是两个必需的扩散时间，a1 是第一个扩散时间的分数。与自由 DNA 链在各个方向上扩散的校准测量不同，膜受体仅沿细胞膜进行二维扩散，需根据分子数量和焦点计算绿色或红色标记蛋白的浓度。利用偏置质量计算共聚焦体积单元的体积。使用与单标记构建体相同的模型拟合双标记样品的两个自相关曲线，并使用双模扩散模型拟合互相关函数，以实现对系统的全局描述。所有三条曲线必须进行联合拟合。扩散项在所有三种作物中均相同。唯一的区别在于声誉时间下降时的互相关函数。根据绿色或红色荧光蛋白各自的分子数量以及共聚焦体积单元的焦点和体积，计算其浓度。利用从 DNA 样本获得的校正因子、细胞样本的振幅比以及相应的浓度，估算细胞样本中相互作用的绿色和红色标记蛋白的比例或浓度。将 FRED 样本的两种交替相关性拟合为单标记样本，并将前向交叉相关性拟合至包含反相关项的双峰扩散模型，其中 AF 反映总反相关的振幅，AR 和 TR 分别反映相应的振幅和弛豫时间。当由于 FRED 导致荧光变化呈反相关时，可能需要一个或多个反相关项，这会导致 FRED 交叉相关函数在低相关时间处出现下陷，同时两个自相关函数相应上升。绿色和红色荧光溶液的校准测量得到的缩放因子在绿色通道为6.5，在红色通道为6.8。因此，在本次测量当天，共聚焦体积的大小分别为1.4和1.9飞升，分子亮度分别为每分子12.5千赫兹和每分子2.6千赫兹。在供体激发后，绿色荧光分子对红色通道的串扰为15%，绿色激发光对红色荧光分子的直接激发为38%。根据我们的DNA测量结果，确定共聚焦重叠体积的校正因子分别为0.6和0.7。转染了单标记构建体的细胞在细胞膜上表现出双峰式的二维扩散行为，其中大约一半的分子在50至100毫秒的时间尺度上缓慢扩散，另一半则在约2毫秒的时间尺度上相对快速地扩散，该现象在两种构建体中均存在。此外，还存在三重闪烁现象。然而，在红色水平的 Snap 融合蛋白中，在 180 微秒处检测到另一个弛豫时间，这可能源于未结合的 Snap 直链形式。从双标记本身来看，当与抗 Snap 构建体相交时，两个标记位于细胞膜的两侧，此时收集到的测量数据较少，且噪声和红色外套相关性降低。而此处的 PI 互相关值相当高。在此情况下，70% 的分子表现为慢速过程，时间尺度在一百毫秒以下，仅有 30% 表现为快速过程，约在一毫秒左右，双释放分子的比例较低，介于 15% 至 25% 之间。CT 快照的数据看起来更优，噪声也更少。然而，预期的最深前向反相关无法观察到，很可能被高水平的串扰、直接受体激发以及两种荧光团的三重态闪烁所掩盖。采用能够利用所收集荧光强度 DKS 的数据分析方案，可能有助于挽救这一情况，正如在模拟数据集中所展示的那样。Fred FCS 技术的优势在于，除了可以研究 GPCR 的流动性外，还能够探究其构象动态。然而，在实验室中进行 FRED FCs 实验具有挑战性，需要转染效率高的细胞、高效的标记方法以及经过精确校准的仪器设备。此外，选择合适的 FRED 荧光对也极为关键。关键的实验步骤包括转染条件的优化、背景信号的最小化以及自发荧光的控制。此外，Atoms 分析流程将有助于理解活细胞中受体的各种动态行为。我们希望本方案能为在活细胞实验中开展 FRED FCS 方法提供有用的参考。

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