从脂肪组织和基质血管分数表征中获取间充质干细胞的技术在长期冷冻保存中的应用

在这里，我们已经展示了用于获取和保存良好和有活力的细胞以用于治疗步骤的方案，例如输注多能间充质细胞。这样做的主要优点是，使用这种技术，我们可以从收集的组织中获得在细胞分离步骤中获得的活细胞体积与时间的关系。该技术可以扩展到应用异基因药物和细胞疗法的所有疾病或病症。

该方法还可以应用于药物测试等领域的细胞基因组稳定性测试，在这些领域可以鼓励长期细胞培养。每当操纵活细胞时，都要保持冷静和自信。对败血症要格外小心，并用科学家的眼睛时刻保持警惕，观察任何逆境并做出正确的决定。

首先称量袋子并使用数字非接触式红外临床温度计测量温度。将袋子留在层流室内五分钟，以沉淀油腻层并分离含有细胞的组织。将100毫升含钙的DPBS注入转移袋中，并用手混合。

静置五分钟。然后使用连接到袋适配器的 60 毫升注射器丢弃大部分沉淀的基础液体。重复此过程两次。

在袋中加入100毫升消化液，在37摄氏度下缓慢搅拌30分钟。然后将袋子的所有内容物转移到四个 50 毫升的锥形管中，并在 400G 下在 22 摄氏度下离心 10 分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入5毫升补充有20%胎牛血清的DMEM低葡萄糖。

将 10 微升台盼蓝的新鲜溶液在 0.05% 的蒸馏水中与 10 微升细胞悬浮液混合 5 分钟。使用20倍放大倍率的倒置光学显微镜，并在Neubauer细胞计数室中计数活细胞。将细胞沉淀悬浮在冷冻保护介质中，浓度为每毫升100万个细胞。

然后将1毫升这种混合物放入冷冻瓶中。使用冷却速度为每分钟1摄氏度的冷冻容器，并在80摄氏度下储存一年。一年后，将其储存在浸入液氮气相的标准盒中。

该表列出了来自九名患者的不同手术步骤的数据。根据初始细胞产量，确定每个样品的细胞体积可变。细胞产量较高的样品为1毫升，细胞产量中等的样品为1.1毫升，细胞产量较低的样品为2毫升。

即使观察到胰蛋白酶消化前的相同汇合，传代一代前的细胞产量也有很大差异。因此，这里的细胞可能已经分层生长。代表性图像显示了在光学显微镜下分离后第一次传代处的塑料粘附间充质ADSC。

细胞显示出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附。此处显示了在台盼蓝测定中在Neubauer室中计数的活细胞。该表列出了六名患者的流式细胞术数据。

从这些CD45阴性细胞中，确定了具有不同干细胞标志物组合的ADSC的百分比。代表性图像显示了冷冻保存8个月后病例9中干细胞相关标志物阳性的细胞亚群。这里，R1是在前向散射与侧向散射图中分析的总细胞区域。

R2是CD45阴性区域。该区域的 CD73、CD90 和 CD105 人群呈阳性。软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞中的ADSC分化见此处。

在尝试此过程时，请记住慢慢搅拌，最好用手搅拌，同时在 37 摄氏度下放置 30 分钟以观察粘连和起泡。将工作室温度保持在 25 摄氏度左右，并避免在更高的温度下出现任何热冲击。我们在这里展示的技术可用于成功地从其他组织中分离多能间充质细胞。