Обнаружение спорозоитов Plasmodium у комаров Anopheles с помощью иммуноферментного анализа

Метод ИФА действительно полезен для обнаружения малярийного паразита в комарах-переносчиках с высокой чувствительностью и специфичностью, а также способен обрабатывать большое количество образцов одновременно. Этот метод позволяет исследователям хранить образцы комаров до тех пор, пока они не будут готовы к обработке образцов, и это может быть выполнено для дифференциации видов Plasmodium с использованием видоспецифичных моноклональных антител. Подготовьте образец, отделив голову и грудную клетку комаров от брюшной полости, и поместите их в предварительно маркированную центрифужную трубку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров буфера для измельчения и гомогенизируйте образец пестиком. Промойте пестик 250 микролитрами растирающего буфера, и добавьте раствор в тюбик, чтобы довести итоговый объем до 300 микролитров. Подготовьте планшет ИФА для белка циркумспорозоита и заполните рабочий лист ИФА для спорозоита.

Приготовьте раствор антитела в PBS, и добавьте пять миллилитров раствора на тарелку. Внесите пипеткой по 50 микролитров раствора антитела в каждую лунку планшета ИФА. Накройте тарелку крышкой, и выдерживайте 30 минут или ночь при комнатной температуре.

Отсадите раствор в лунку, и постучите пластиной по бумажному полотенцу пять раз, чтобы удалить жидкость. Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в луночные пластины, и накройте крышкой. Выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре, и хорошо отсасывают содержимое.

Снова постучите тарелкой по бумажному полотенцу, чтобы удалить жидкость. Добавьте 50 микролитров положительного контроля в Н одну и Н две лунки. Затем добавьте 50 микролитров блокирующего буфера в лунки в первую и вторую колонки строк C в G. Добавьте 50 микролитров положительного контроля в две лунки G.

Последовательно разбавляйте положительный контроль, начиная с G 1 и G 2, затем F 1 и F 2 до C 1 и C 2. Добавьте 50 микролитров отрицательного контроля в лунки А один, А два, В один и В два. Извлеките 50 микролитров раствора гомогената, и добавьте его в неизвестную лунку.

Накройте тарелку крышкой и выдерживайте ее при комнатной температуре в течение двух часов. Приготовьте раствор субстрата, смешав субстрат А и В в соотношении один к одному. Определяют необходимый объем исходя из добавления пяти миллилитров рабочего раствора конъюгированного антитела в каждую пластину.

Оцените активность пероксидазы, добавив пять микролитров раствора меченого пероксидазой антитела к 100 микролитрам раствора субстрата в пробирке объемом 1,5 миллилитра. Отсадите из лунки содержимое, и удалите жидкость, поставив тарелку вверх дном на бумажное полотенце. Промойте лунки два раза 200 микролитрами PBS Tween.

Вдохните содержимое лунки и постучите по пластине пять раз. Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров раствора антител, меченных пероксидазой. Затем выдерживают в темноте в течение одного часа при комнатной температуре.

Впитайте в лунку содержимое, и постучите по тарелке по бумажному полотенцу пять раз. Промойте лунки 200 микролитрами PBS Tween три раза, вдохните содержимое и пять раз постучите по пластине. Добавьте по 100 микролитров раствора субстрата в каждую лунку.

Накройте тарелку крышкой, и выдерживайте в темноте 30 минут при комнатной температуре. После инкубации считайте абсорбцию на расстоянии от 405 до 414 нанометров с помощью планшетного ридера ELISA. Пометьте образцы, имеющие абсорбцию значением выше порогового значения, как положительные, и определите концентрацию CSP в образце с помощью стандарта.

Постройте график зависимости значений поглощения от концентрации раствора для построения стандартной кривой. Определите наилучшее соответствие с помощью метода линейной регрессии. Решите уравнение каждого значения поглощения для положительного образца, чтобы определить концентрацию CSP.

Через 30 минут проведения ИФА с АБТС спорозоитная инфекция может быть обнаружена по появлению слабого зеленого цвета в лунке. Положительный контроль не показал изменения цвета в лунке. Определены значения абсорбции для отрицательных и положительных скважин.

Положительная лунка показала значение поглощения, которое было выше порогового значения, в то время как отрицательный контроль показал значительно более низкие значения. Кроме того, были получены значения поглощения других 80 неизвестных скважин. Сплошной линией обозначено среднее поглощение отрицательных контрольных лунок, а пунктирной линией обозначен порог положительности.

С помощью стандартной кривой концентрация CSP в лунке A 7 была определена равной 0,35 пикограмм на микролитр. Кроме того, все образцы и раствор следует хранить в холодильнике, чтобы предотвратить рост микроорганизмов. Исследователям рекомендуется подтверждать положительные результаты другими методами, такими как ПЦР.

Это значительно повысит уверенность, особенно когда единственное значение оценивается выше порога. Этот метод позволил исследователям проводить более масштабные исследования возможной инфекции у комаров, что важно для идентификации основного переносчика.