Nettoyage optique des tissus végétaux pour l’imagerie par fluorescence

Cette méthode peut être utile dans l’imagerie de plantes entières pour révéler la morphologie intacte, les processus de développement et les interactions plante-microbe. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons observer directement l’intérieur d’un corps végétal sans lui infliger de dommages. Comme cette méthode s’applique à un large éventail d’espèces et de tissus végétaux, elle peut aider à accélérer la découverte de nouveaux phénomènes dans la recherche en biologie végétale.

La fixation est une étape critique de cette procédure. Avant l’étape de nettoyage, il faut vérifier l’intensité de la protéine fluorescente après la fixation. Pour commencer, immergez les échantillons de plantes dans la solution fixatrice dans un microtube et assurez-vous que le volume de la solution fixatrice est plus de cinq fois supérieur au volume de l’échantillon.

Scellez le microtube avec un parafilm et faites des trous à l’aide d’une aiguille. Placez le microtube dans un dessiccateur et ajustez lentement le degré de vide à environ 690 millimètres de mercure afin que des bulles apparaissent progressivement à partir des échantillons. Éteignez la pompe à vide après avoir évacué le dessiccateur.

Éventilez soigneusement le dessiccate sans déranger les échantillons. Rallumez la pompe à vide et éteignez-la après avoir évacué le dessiccateur. Ouvrez soigneusement le dessiccateur sans heurter la solution fixatrice dans le microtube.

Retirez la solution fixative et ajoutez 1x PBS avec une micro pipette. Après avoir stocké pendant une minute, remplacez l’ancien PBS par un nouveau PBS 1x. Après avoir retiré le PBS à cinq fois le volume de l’échantillon de la solution de nettoyage, scellez le microtube avec un parafilm et faites des trous avec une aiguille.

Placez les échantillons dans le dessiccateur. Évacuez et éteignez la pompe à vide. Ouvrez doucement le dessiccateur, puis fermez le microtube.

Inverser le microtube, tous les un à deux jours pour accélérer le processus de nettoyage. Pour le cadre d’espacement, coupez une feuille de caoutchouc de silicone avec une lame de rasoir en ajustant l’épaisseur de la feuille de caoutchouc de silicone en fonction de l’épaisseur de l’échantillon. Placez le cadre en silicone sur un verre de couverture, puis placez les échantillons traités dans le cadre et ajoutez environ 100 microlitres de solution de nettoyage pour éliminer les bulles.

Couvrir avec un autre verre de couverture pour éviter l’évaporation de la solution de nettoyage. Observez les échantillons au microscope fluorescent. Après observation, retourner les échantillons à la solution de nettoyage dans un microtube.

Des feuilles fixes de diverses espèces ont été incubées dans PBS ou ClearSee pendant huit jours, dans ClearSee ou ClearSeeAlpha pendant deux jours. ClearSee peut effacer les feuilles de diverses espèces. Après avoir extrait le cuticulaire, ClearSee a pu nettoyer les feuilles de riz.

Comme le composant sulfite de sodium dans ClearSeeAlpha empêche l’oxydation des polyphénols en raison de l’effet réducteur, ClearSeeAlpha pourrait éliminer les pistils du tabac et de la tirania sans aucune pigmentation brune. Les feuilles H2B-mClover d’arabidopsis thaliana, promoteur de l’ubiquitine-10, ont été traitées avec du PBS ou du ClearSee pendant trois jours. Le traitement ClearSee a réduit la couleur vert pâle de la feuille d’arabidopsis H2B-mClover et amélioré l’intensité de fluorescence de H2B-mClover par rapport à l’incubation PBS.

Les feuilles traitées ClearSee ont été observées par microscopie à excitation à deux photons avec une excitation de 950 nanomètres. La paroi cellulaire est tachée de calcaflour-blanc. Les noyaux sont marqués avec le promoteur de l’ubiquitine-10, H2B-mClover.

Les images Y Z et X Z sont des coupes transversales à la position indiquée par les lignes pointillées blanches. La préparation de la solution fixative est importante pour fixer les échantillons. Cependant, des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager les échantillons sous vide.

L’imagerie microscopique peut être réalisée pour étudier plusieurs modèles d’expression génique et les communications intracellulaires au cours du développement de la plante et de l’infection à la suite de cette procédure.