ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

このプロトコルにより、アフリカのマラリアベクターのマラリア感受性に対する治療の効果を検出することができます。例えば、ヒトから蚊への感染を阻止することを目的とした化合物。この技術により、研究者は、毒性GATEが利用可能になる前であっても、実験室条件下で多数の化合物を評価することができます。

中腸解剖は最初は難しいかもしれませんが、少し練習する必要があります。また、オーシストを識別できるようにすることは必ずしも容易ではありません。まず、口内吸引器を使用して、給餌されていない25匹の雌のハマダラカの蚊を350ミリリットルの給餌カップに入れます。

対照群と治療群を区別するために、カップに明確にラベルを付けます。含まれるテクニカルレプリケートの数に応じて、治療ごとのカップ数を選択します。ガラスフィーダーシステムをウォーターバスに接続し、温度を摂氏37度に維持します。

次に、牛の腸または合成膜を水道水ですすぎ、各フィーダーに適合する断片に切断して準備します。各フィーダーの下部を覆い、メンブレンをゴムバンドで固定します。給餌カップを感染カップとして使用するには、まず、膜をカップのネットの上に置いてください。

次に、感染カップをフィーダーの下に置きます。次に、1ミリリットルの配偶子細胞感染血液をコントロールカップのフィーダーに追加し、配偶子細胞感染血液をテスト化合物とともに治療カップのフィーダーに追加します。その後、蚊を約40分間食べさせます。

給餌後、カップからフィーダーを取り外し、フィーダーをすすぎ、余分な血液を次亜塩素酸塩で処理します。次に、すべての蚊を氷の上に1〜2分間たたき落とし、腫れた赤い腹部を探して血の食事をした蚊を選択します。各感染カップに隔日で与えられる砂糖水を10%砂糖水パッドに交換し、バイオセーフティチャンバーで感染カップを8〜10日間インキュベートします。

給餌の8〜10日後に、感染した蚊を氷の上に置いて倒します。次に、それらを70%エタノールで標識したチューブに移し、各治療グループのコントロールを別々のチューブに保ちます。対照群と試験群を別々に保ち、ろ紙で裏打ちされたラベルの付いたペトリ皿に蚊を移します。

適切にマークされたスライドガラスにPBSを滴下し、濾紙から一滴に蚊を移します。解剖針で蚊の胸部を固定します。次に、鉗子で7番目の腹部セグメントを引っ張って中腸を取り除き、新しい顕微鏡スライド上の0.1%水銀クロムの液滴に移します。

腸を8〜10分間染色したままにします。次に、汚れた腸にカバースリップを置き、20〜40倍の倍率で明視野照明の下でそれを表示します。対照および各治療群の中腸当たりのオーシストの数を記録する。

この研究では、化合物MMV1581558は、対照と比較して、雌のハマダラカガンビア蚊の中腸内の熱帯熱マラリア原虫の数を大幅に制限することがわかりました。対照群では、中腸におけるオーシストの平均有病率は89%で、中腸あたりの平均強度は9.5オーシストでした。しかし、MMV1581558治療群では、オーシストの平均有病率は36%で、平均強度は中腸あたりわずか1.5オーシストでした。

したがって、MMV1581558処理は、3つの生物学的複製すべてにおいて58%の伝達遮断活性および82%の伝達低減活性をもたらした。蚊が健康な配偶子細胞培養物を食べていることを確認することが重要です。これらが未熟な配偶子細胞である場合、またはステージ5の配偶子細胞ではない場合、蚊に感染する可能性は限られているか不可能です。

アッセイは視覚的形態学的同定法を使用しますが、分子定量アッセイを使用できます。ただし、これはコストがかかり、リソースに制約のあるラボでの使用が制限される可能性があります。この技術を行う能力を持つことは、蚊のほとんどすべての間のマラリアの有病率と強度の変化を評価するための新しい道を開きます。

たとえば、種のベクトル容量を比較します。