Name: 3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 배우세요 3차원 교모세포종 오가노이드 배양법으로 종양 미세환경과 세포 다양성을 재현하는 방법을. 이 기법은 약물 효능 및 내성 메커니즘 연구와 맞춤형 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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귀중한 조언과 지속적인 지원에 대해 Justin Lathia 박사에게 감사드립니다. 또한 카트리나 파이프, 리사 월리스, 마야 카미의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다.

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GBM 오가노이드는 더 큰 세포 및 미세 환경 이질성 4,22,30을 포함하는 전통적인 영역에 대한 보완적인 배양 방법입니다. 더 많은 시간과 자원 집약적이지만 오가노이드 배양은 종양 내 행동 및 약물 내성 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
GBM은 CSC 5,31의 인구에 의해 구동되며, 이러한 방법은이 CSC 인구의 지속적인 성장과 자체 갱신을 허용하기 위해 개발되었습니다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)는 줄기 세포 유지 및 성장을 향상시키고 활성 수용체 티로신 키나제 (RTK) 신호를 제공하는 것으로 알려져 있습니다. GBM 종양 내에서 이질적인 세포 집단과 뚜렷한 종양 미세 환경의 형성은 CSC 행동을 지원하는 데 의존합니다. lrECM의 선택은 라미닌이 풍부한 뇌 환경을 모방하고 오가노이드 배양의 세포가 침입에 의해 자가 조직화되고 이동하도록 지원합니다. 일부 그룹은 lrECM 또는 EGF/FGF 농축 배지24,28을 사용하지 않고 오가노이드 배양을 확립했으며, 이는 이 배양 방법의 보다 시간 효율적인 방식과 성장을 촉진하기 위한 발암성 신호전달의 더 강력한 선택을 제공할 수 있지만, 이러한 방법은 오가노이드의 세포 이질성을 가장 잘 확립하기 위해 전줄기세포 환경을 최적화하기 위해 선택되었습니다. 대뇌 오가노이드와 GBM 오가노이드 모두 이전 문헌 21,32,33에서 lrECM으로 만들어졌습니다. 오가노이드 내에서 발견되는 종양 집단과 공간적 변화에 관한 데이터를 확립했지만, 오가노이드 내의 비종양 집단과 원래 환자 표본에서 생존하는 기간에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 특정 IHC 염색(예: CD45)은 이러한 데이터를 제공할 수 있으며 향후 오가노이드에 대한 흥미로운 연구 포인트가 될 수 있습니다.
오가노이드 배양의 용도를 아는 것은 적절한 방법을 선택하는 데 중요합니다. 1차 표본에서 오가노이드를 확립하는 것과 특정 실험을 위해 균일한 오가노이드를 성장시키는 것은 약간 다른 절차를 거칩니다. 오가노이드가 어떻게 성숙하고 lrECM 스캐폴드를 시각적으로 채우는지에 대한 이해는 오가노이드 배양에 적절한 시간과 자원을 할당할 수 있는 데 중요합니다. 오가노이드에 있는 세포의 희소 영역은 천천히 확장되고 성장하여 lrECM을 채우며, 이는 표본의 행동에 따라 2-8주가 소요될 수 있습니다. 이 성장률은 각 표본에 다소 내재되어 있습니다. 그것은 유기체의 다른 배치에 걸쳐 보존되며 구체 성장의 상대적 속도와 상당히 일치합니다. 오가노이드는 1년 이상 유지될 수 있으며 마우스로의 이종이식에서 종양 형성 능력을 유지합니다. 그러나 실험실 자원(재료 및 시간 모두)을 낭비하지 않도록 뚜렷한 목적으로 재배하는 것이 좋습니다4. 오가노이드 성장은 여러 웰 크기 및 형식으로 테스트되었으며, 10cm 플레이트가 최적의 세포 생존율을 유지하기 위한 이상적인 설정이며, 그 다음에 웰당 3개의 오가노이드가 있는 6웰 플레이트가 뒤따른다는 것을 보여줍니다(34). 오가노이드는 2차원 배양 제품에 비해 더 많은 배지를 소비하며 더 작은 웰 형식을 사용하면 적절한 유지 관리가 이루어지지 않습니다. 예를 들어, 96웰 포맷 플레이트의 한 웰은 오가노이드 성장을 지속하기에 오가노이드의 크기에 비해 충분한 공간이나 배지 부피를 갖지 않습니다.
유기체가 확립함에 따라 관찰력은 성공을 높이는 데 중요합니다. 처음에 오가노이드는 미디어를 천천히 소비하지만 밀도가 높아지고 성숙해짐에 따라 미디어를 더 빨리 소비합니다. 미디어에 페놀 레드를 추가하면 미디어 소비의 지표 역할을 할 수 있습니다. 배지가 더 노란색이면 더 많은 양의 배지를 교환하거나, 플레이트의 총 배지 양을 늘리거나, 성장을 따라잡기 위해 여러 세포 배양 플레이트에 오가노이드를 나누거나, 실험 일정을 조정하는 등 공급 패턴을 조정하라는 메시지가 표시될 수 있습니다. 
여러 면에서 오가노이드는 암 연구를 수행하는 비효율적인 방법입니다. 그들은 오랜 시간 척도를 포함하며 GBM 구 문화에 비해 비싸고 자원이 많이 듭니다. 그러나 세포 및 미세 환경 다양성을 재현하기위한 대체 방법 인 환자 유래 이종 이식편과 비교할 때 더 간단하고 저렴하며 제어 할 수 있습니다. 오가노이드를 가장 잘 사용할 때를 선택하는 것은 암 연구자에게 중요합니다. 그들은 전통적인 구체 또는 부착 문화를 대체하기위한 것이 아니며 이종 이식 모델을 대체하기위한 것이 아닙니다. 오가노이드는 올바른 과학적 질문에 적용될 때 이 두 시스템의 이점을 결합할 수 있으며 그렇지 않으면 숨겨져 있을 종양 세포 생물학을 관찰할 수 있습니다. 과학계는 오가노이드가 제공하는 학습 기회를 이해하기 시작했을 뿐이지만, GBM의 복잡한 생물학을 이해하는 데 미래에 귀중한 도구가 될 것임은 분명합니다.

교모세포종(GBM)은 진단15개월 후 약 15개월의 암울한 예후를 보이는 가장 흔하게 발생하는 원발성 뇌종양입니다. 전임상 연구에서 효과적인 치료법은 종종 환자 2,3에서 효과가 없을 수 있습니다. 열악한 임상 반응은 GBM의 미세 환경 적 이질성과 복잡한 종양 내 상호 작용을 포함한 많은 요인에 기인합니다. 이들은 전통적인 부착 또는 구체 배양 방법으로 실험실 환경에서 재현하기 어려울 수 있습니다4. GBM 내에자가 재생 암 줄기 세포 (CSC)의 하위 집합이 존재하는 것도 이러한 복잡성에 기여할 수 있습니다 5,6. CSC는 종양 전파에 중요하며 활성 혈관 신생, 암 침윤 및 방사선 7,8,9를 포함한 치료법에 대한 내성을 촉진하여 종양 성장을 유지합니다. CSC는 종양 전체에 균일하게 분포하지 않고 오히려 혈관 주위 틈새 및 회음부 영역을 포함한 특정 미세 환경 내에서 풍부하며, 이는 각각 세포 상태10,11,12,13,14의 뚜렷한 분자 조절을 제공합니다. CSC는 미세 환경 신호의 수동적 수신자가 아니라 대신 자신의 미세 환경을 리모델링 할 수있는 능력을 가지고 있습니다 7,15,16. CSC의 미세 환경은 영양 부족, pH 및 저산소증17,18,19,20과 같은 압력에 반응하여 줄기 세포 상태의 유지를 촉진 할 수 있으며, 이는 모델 시스템에서 이러한 조건의 중요성을 시사합니다. 따라서 종양 내의 다양한 세포 미세 환경의 요약은 치료 내성을 이해하고 새로운 치료법을 식별하는 데 중요합니다.
3 차원 문화는 최근 몇 년 동안 인기가 높아졌습니다21,22. 오가노이드는 다른 유형의 암에서 사용되어 왔으며, 세포를 오가노이드로 유지하는 주요 목표는 이질적인 세포 집단(그 중 다수는 일반적으로 보다 균질한 구 배양에서 경쟁할 수 있음)의 성장과 유전적 특이성을 가진 지역 종양 미세환경으로 간주되는 공간적 다양성을 허용하는 것입니다.4,23,24,25,26 . 암세포의 3 차원 배양을위한 많은 방법이 있으며, 각각 장점과 단점27,28,29가 있습니다. 오가노이드 배양은 전통적인 부착 또는 구 배양을 대체하기 위한 것이 아닙니다. 세포 미세 환경과 종양 세포 반응 사이의 상호 작용이 중요한 특정 질문이있을 때 2 차원 방법에 대한 보완 기술로 가장 잘 사용됩니다.
이 기사에서는 1차 환자 샘플 또는 환자 유래 배양에서 GBM 오가노이드를 생성하는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법을 설명합니다. 우리는 3차원 오가노이드 배양을 위한 두 가지 다른 목표를 다룹니다: (1) 균일성에 관계없이 최대 생착 잠재력을 가진 1차 환자 조직에서 오가노이드를 확립하거나 (2) 보다 정량적인 실험 사용을 위해 균일한 오가노이드를 성장시킵니다. 1차 검체를 오가노이드로 설정할 때 초기 배양을 확립하기 위해 최대 세포 수와 유형을 유지하는 것이 우선이기 때문에 단일 세포를 필터링하거나 세포를 계수할 필요가 없습니다. 그러나 비교 실험을 위해 오가노이드를 성장시킬 때는 실험 일관성을 위해 복제 오가노이드를 비교할 수 있도록 단일 세포 여과 및 세포 계수가 필요합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양을 확립하고 균일한 오가노이드를 만드는 방법뿐만 아니라 오가노이드를 매립 및 보존하기 위한 정제된 방법과 면역조직화학, 면역형광법 및 GBM 오가노이드의 총 세포 생존율 평가를 포함한 표준 세포 배양 실험을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>3,3-디아미노벤지딘(DAB) 정제</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>3,3-디아미노벤지딘(DAB) 정제</td></tr><tr><td>96-웰 PCR 플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96-웰 PCR 플레이트</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>세포 박리 용액</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>항생제-항진균제</td></tr><tr><td>B-27 보충제 - 비타민 A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>12587001 B-27 보충제 - 비타민 A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>블루잉 시약</td></tr><tr><td>세포 여과기 (70 &micro; m)</td><td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>세포 여과기(70 &micro; m)</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>발광 세포 생존율 분석</td></tr><tr><td>Clarifier 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>핵 헤마톡실린 정화 시약</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>크실렌 대체물</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hematoxylin</td></tr><tr><td>Glutamine 0.85% NaCl</td> 중 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>글루타민 0.85% NaCl (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>라미닌이 풍부한 세포외 매트릭스</td></tr><tr><td>Mini PAP 펜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>소수성 배리어 펜</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>Neurobasal 매체 - 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Neurobasal 매체 - 페놀 레드 (500 mL)</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청 (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>일반 당나귀 혈청 (NDS)</td></tr><tr><td>PBS 중 파라포름알데히드 4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>파라포름알데히드 4% PBS</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마</td><td>P0290</td><td>페놀 레드 (0.5%)</td></tr><tr><td>DAPI ThermoFisher</td> Scientific <td>P10144</td><td>액체 경화 마운트를</td>사용한 ProLong Gold <td>Antifade Mountant</td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG-01M</td><td>재조합 인간 EGF 단백질(250 &마이크로; g/mL)</td></tr> <tr><td>재조합 인간 FGF 기본</td><td>R& D 시스템</td><td>4144-TC-01</td><td>재조합 인간 FGF 베이직 (250 &마이크로; g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain 항체 희석제</td><td>세포 신호</td><td>8112</td><td>항체 희석제</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC 검출 시약</td><td>세포 신호</td><td>8114</td><td>면역조직화학 검출 시약</td></tr><tr><td>SignalStain 구연산염 마스킹 해제 용액</td><td>세포 신호</td><td>14746</td><td>구연산염 마스킹 해제 용액</td></tr><tr><td>단일 가장자리 면도날</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>단일 가장자리 면도날</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>일회용 cryomolds</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 화합물</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>최적 절단 온도 화합물</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stain ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Cell impermean stain (0.4%)</td></tr><tr><td>크실렌</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>크실렌</td></tr></tbody></table>

3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

교모세포종(GBM)은 가장 흔하게 발생하는 원발성 악성 뇌암으로 예후가 매우 좋지 않습니다. 종양 내 세포 및 분자 다양성뿐만 아니라 종양 미세 환경 간의 복잡한 상호 작용은 효과적인 치료법을 찾는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 전통적인 부착 또는 구 배양 방법은 이러한 복잡성을 가릴 수 있는 반면, 3차원 오가노이드 배양은 지역 미세 환경 구배를 요약할 수 있습니다. 오가노이드는 환자 종양 구조를 더 잘 모방하고 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하며 중간 처리량 실험에 사용할 수 있는 3차원 GBM 배양 방법입니다. 3차원 오가노이드 배양은 기존 배양에 비해 더 힘들고 시간이 많이 걸리지만 고유한 이점을 제공하며 현재 체외 시스템과 생체 내 시스템 간의 격차를 해소하는 역할을 할 수 있습니다. 오가노이드는 종양 행동과 내성 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 암 생물학자들의 무기고에서 귀중한 도구로 자리 잡았으며 그 응용 분야는 계속 증가하고 있습니다. 여기에서는 GBM 오가노이드를 생성하고 유지하는 방법에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 냉동 및 파라핀 임베딩 기술을 모두 사용하여 오가노이드 샘플 임베딩 및 절편을 수행하는 방법에 대한 지침, 오가노이드 절편에 대한 면역조직화학 및 면역형광 프로토콜에 대한 권장 사항, 총 오가노이드 세포 생존율 측정도 모두 설명되어 있습니다.

그림 1 은 10x 배율에서 광학 현미경을 통해 관찰된 초기 오가노이드 성장을 보여줍니다. 그림 1A 는 중앙도에서 lrECM을 통한 단일 세포의 이동 및 침입을 보여줍니다. 세포는 계속해서 확장되어 lrECM을 '식민지화'할 것이며, 육안 검사에 의해 더 조밀하고 결국 불투명하게 보일 것입니다. 그림 1B 는 동전의 크기에 비해 배율 없이 여러 성숙한 유기체(7주)를 보여줍니다.
도 2 는 활성 증식의 마커인 포스포히스톤 H3에 대한 GBM 오가노이드의 면역조직화학적 염색을 입증한다. 대부분의 고도로 증식된 세포는 오가노이드 코어에 비해 오가노이드 주변에서 볼 수 있습니다. 양성 염색은 갈색/구리 모양을 갖습니다.
그림 3 은 3D 특이적 발광 세포 생존율 분석을 사용하여 GBM 오가노이드에서 총 세포 수를 균질화하고 측정하는 과정을 설명합니다. GBM 오가노이드에 존재하는 많은 수의 세포로 인해, 더 큰 오가노이드 구조는 발광 분석 시약에서 분쇄함으로써 초기에 균질화된다. 그런 다음 총 유기형 용해물의 분획을 개별 웰에 로딩하고 적절한 멀티웰 플레이트 판독기에서 배양 및 판독하기 전에 추가 발광 분석 시약으로 희석합니다.
그림 4 는 오가노이드에 대한 DMSO(일반 비히클) 제어 데이터를 나타냅니다. 플로팅된 데이터는 오가노이드 내 및 오가노이드 간 일관성을 보여줍니다. 발광 생존율 데이터는 일반적으로 실험 데이터를 생성할 때 각 시편에 대한 대조군으로 정규화됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> 그림 1: 광학 현미경으로 보기(×10). (A) 라미닌이 풍부한 세포외 기질 전반에 걸쳐 GBM 세포의 이동/침입을 보여주는 초기 오가노이드 성장. (B) 동전의 크기에 비해 성숙한 유기체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> 그림 2: GBM 오가노이드의 면역조직화학. (A, B) 활성 증식에 대한 포스포-히스톤 H3 염색 세포를 보여주는 GBM 오가노이드. 스케일바는 A와 B에 대해 각각 600μm와 300μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> 그림 3: 오가노이드에 대한 발광 세포 생존율 프로토콜. (A) 개별 오가노이드를 작은 원심분리기 튜브로 옮기고 과도한 배지를 제거합니다. (B) 500μL의 1:1 PBS와 발광 세포 생존율 분석 혼합물을 각 튜브와 피펫에 적극적으로 추가하여 오가노이드를 분해합니다. (C) 이 오가노이드 혼합물 25μL와 동일한 1:1 PBS 및 발광 세포 생존율 분석 혼합물 75μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. (D) 쉐이커에 2 분 동안 놓은 다음 RT에서 20 분 동안 인큐베이션한 다음 플레이트 리더에서 발광을 읽습니다. BioRender.com 사용하여 만든 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> 그림 4: 세포 생존율. 4명의 환자 표본에 대한 4개의 오가노이드의 6가지 기술 복제에 대한 0.1% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 오가노이드에 대한 세포 생존율 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>양</td>
		</tr><tr><td>신경 기저 배지에서 페놀 레드를 뺀 값</td>
			<td>500 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>비타민 A를 뺀 B-27 보충제(×50)</td>
			<td>10 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>항균제(×100)</td>
			<td>5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>나트륨 피루 베이트 (100 mM)</td>
			<td>5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>0.85 % NaCl (200 mM) 중 글루타민</td>
			<td>5 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>재조합 인간 FGF 염기성 (250 μg / mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>재조합 인간 EFG 단백질 (250 μg / mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>페놀 레드</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 신경기저 배지 완성(NBMc) 제형
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>시간</td>
		</tr><tr><td>50% 에탄올</td>
			<td>3 민</td>
		</tr><tr><td>75% 에탄올</td>
			<td>3 민</td>
		</tr><tr><td>95% 에탄올</td>
			<td>3 민</td>
		</tr><tr><td>95% 에탄올</td>
			<td>4 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>3 민</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>4 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>3 민</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>4 분</td>
		</tr><tr><td>석랍</td>
			<td>15 분</td>
		</tr><tr><td>석랍</td>
			<td>15 분</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 소형 오가노이드(직경 3mm 미만)의 처리 일정
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>시간</td>
		</tr><tr><td>50% 에탄올</td>
			<td>6 분</td>
		</tr><tr><td>75% 에탄올</td>
			<td>6 분</td>
		</tr><tr><td>95% 에탄올</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>95% 에탄올</td>
			<td>8 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>8 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>5 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>8 분</td>
		</tr><tr><td>석랍</td>
			<td>30 분</td>
		</tr><tr><td>석랍</td>
			<td>30 분</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 대형 오가노이드(직경 3mm 이상)의 처리 일정
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>시간</td>
		</tr><tr><td>헤마톡실린</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>실행 중 diH2O</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>핵 헤 마톡 실린 정화 시약</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>실행 중 diH2O</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>블루잉 시약</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>실행 중 diH2O</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>70 % 에탄올</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>100% 에탄올</td>
			<td>1 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>2 분</td>
		</tr><tr><td>크실렌 대체물</td>
			<td>2 분</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 헤마톡실린 카운터스테인

여기에서는 1차 환자 검체 또는 환자 유래 세포 배양에서 교모세포종(GBM) 오가노이드를 생성하고 성숙할 때까지 유지하는 방법을 설명합니다. 이러한 GBM 오가노이드는 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하고 생체 외 종양 미세 환경을 재현합니다.

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

교모세포종에 대한 치료법을 찾는 것은 종양에 존재하는 세포 다양성과 다양한 미세 환경 간의 상호 작용으로 인해 어렵습니다. 오가노이드는 공간적 다양성의 일부를 재현하는 데 도움이 될 수 있으며, 이를 사용하여 종양의 생물학을 더 잘 이해할 수 있습니다. 전통적인 세포 배양 방법은 균일한 종양 세포 집단을 생성하는 경향이 있지만 오가노이드는 교모세포종의 분자 및 세포 다양성을 더 잘 모방하고 종양 내 상호 작용을 더 잘 모델링할 수 있습니다.오가노이드는 약물 효능 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 임상 요법에 대한 내성은 이 질병의 임상적 현실을 반영하여 전통적인 구체 문화가 아닌 오가노이드에서만 나타날 수 있습니다. 오가노이드는 화학요법의 지역적 효과를 입증하는 데 도움이 될 수 있습니다.그들은 새로운 틈새 특정 치료법을 발견하는 데 사용될 수 있으며 미래에 개인화 된 의학을위한 예측 도구 역할을 할 수도 있습니다. 오가노이드를 만드는 데 사용되는 일부 재료는 온도에 민감하며 이러한 재료를 적절한 온도로 유지하지 않으면 오가노이드를 만들거나 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 파라필름 시트에서 왁스 페이퍼를 꺼내 두 개의 멸균 96웰 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR 플레이트 사이에 배치하여 배양 후드 아래에서 오가노이드 몰드 준비를 시작합니다.파라필름 내부가 깨끗한지 확인하십시오. 상판에 균일한 압력을 가하여 구멍을 만들지 않고 파라필름에 2mm 깊이의 작은 딤플을 형성합니다. 플레이트를 분리하십시오.보조개 파라 필름이 상판에 달라 붙습니다. 그런 다음 상판을 드라이 아이스에 30 초 동안 놓습니다. 멸균 집게를 사용하여 빠른 동작으로 상판에서 파라필름을 당깁니다.냉동 파라 필름은 제거하기가 더 쉽습니다. 완성된 파라필름 몰드를 뚜껑이 덮인 멸균 10cm 세포 배양 접시에 넣습니다. 교모세포종 또는 GBM 부착성 배양물로부터 단세포 현탁액을 제조하기 위해, 사용된 배지를 플레이트로부터 제거한다.그런 다음 실온에서 2 밀리리터의 세포 분리 용액을 플레이트에 넣고 플레이트를 37도에서 3 분 동안 배양합니다. 현미경으로 플레이트에서 세포 분리를 확인한 후 8 밀리리터의 신경 기저 배지 완료 또는 NBMc 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중화시킵니다. 단일 70-마이크론 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 변형시킨다.세포를 120 배 G에서 5 분 동안 스핀 다운합니다. 그런 다음 상청액을 제거하고 세포를 NBMc 1 밀리리터에 재현탁시킵니다. 세포 불 투과성 염색을 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 세포를 계수합니다.단일 세포 현탁액에서 오가노이드를 만들려면 얼음 양동이 또는 콜드 블록의 작은 원심분리 튜브에 적절한 양의 라미닌이 풍부한 세포외 기질(lrECM)을 추가합니다. 유기체 당 20, 000 개의 세포를 함유하는 세포 혼합물을 제조한다. lrECM 세포 현탁액 혼합물을 완전히 혼합하여 세포가 침전되어 불균일한 오가노이드 형성을 초래하지 않도록 합니다.다음으로, 20 마이크로 리터의 혼합물을 파라 필름 몰드에 조심스럽게 피펫하여 진주 모양의 물방울을 형성합니다. lrECM 중합을 방지하기 위해 2-3개의 오가노이드마다 피펫 팁을 냉각시키십시오. 원하는 수의 오가노이드가 10cm 배양 플레이트의 파라필름 몰드에 피펫팅되면 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 오가노이드를 1-2시간 동안 배양합니다.오가노이드가 응고된 후 P1000 팁을 사용하여 NBMc 배지로 파라필름 몰드에서 오가노이드를 부드럽게 씻어내고 20ml의 NBMc가 포함된 새로운 10cm 배양 플레이트에 수집합니다. 배양 플레이트를 4일 동안 흔들지 않고 인큐베이터에 넣습니다. 4 일 후 플레이트의 미디어를 교체하십시오.이렇게 하려면 세포 배양 플레이트 아래에 어두운 종이 한 장을 놓습니다. 플레이트를 기울이고 20 초 동안 기다립니다. 유기체가 접시 바닥에 완전히 가라 앉으면 큰 유리 피펫으로 천천히 미디어를 제거하십시오.새 배지를 추가한 후 플레이트를 80RPM의 궤도 셰이커의 인큐베이터에 놓고 그 후 2-3일마다 배지를 교환합니다. 오가노이드의 성장은 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 중앙도에서 초기 오가노이드 성장은 lrECM을 통한 이동 및 단일 세포 침습을 보여주었습니다.7 주에 성숙한 유기체는 동전의 크기에 상대적이었습니다. GBM 오가노이드를 포스포-히스톤 H3로 염색한 결과, 코어에 비해 오가노이드 둘레에서 갈색 또는 보라색으로 나타나는 고도로 증식된 세포가 나타났습니다. 0.1%DMSO의 오가노이드에 대한 세포 생존율 데이터는 오가노이드 내 및 오가노이드 간 일관성을 입증했습니다.유기체 바이오 매스 및 매체 산성화에주의하십시오. 오가노이드가 배지를 너무 빨리 통과하는 경우 배지를 더 자주 교환하거나 추가 플레이트 간에 오가노이드를 분할해야 합니다. 성숙한 오가노이드는 치료법 실험에 사용하거나 면역조직화학 또는 면역형광과 함께 사용하기 위해 포매 및 절편화할 수 있습니다.해리된 오가노이드는 FACS 분석에 사용될 수 있다. 이러한 오가노이드는 최근 공간적으로 구별되는 암 줄기 세포 틈새에서 필수적인 표적을 발견하기 위해 3차원 기능 스크리닝에 사용되었습니다. 우리는 또한 이러한 모델을 사용하여 생체 내 테스트 전에 다양한 약물과 치료법의 우선 순위를 정하고 있습니다.

maintaining-human-glioblastoma-cellular-diversity-ex-vivo-using-three

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 교모세포종 조직에서 유기형 절편 배양의 생성 및 유지를 보여줍니다. 분리된 조직은 아가로스 매트릭스에 내장되고 얇은 절편은 비브라톰을 사용하여 얻습니다. 그런 다음 이러한 절편을 마이크로플레이트 내의 투과성 멤브레인 삽입물에 놓고 장기 유지 관리를 위해 슬라이스 배양 유지 매체에서 배양합니다.

인간 교모세포종 조직으로부터 Slice 배양 생성 및 유지

이 비디오는 단세포 현탁액에서 뇌종양 오가노이드의 준비 및 배양에 대해 설명합니다. 라미닌이 풍부한 세포외 기질을 영양소를 위한 골격 및 배양 배지로 사용하여 세포가 오가노이드 내에서 증식하고 자가 조직화되도록 촉진합니다. 그 결과, 세포 다양성과 뇌종양의 미세환경을 모방하는 체외 오가노이드가 생성됩니다.

Generating an Organoid Culture from a Brain Tumor Cell Suspension(뇌종양 세포 현탁액에서 오가노이드 배양 생성)

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

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실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

배우세요 3차원 교모세포종 오가노이드 배양법으로 종양 미세환경과 세포 다양성을 재현하는 방법을. 이 기법은 약물 효능 및 내성 메커니즘 연구와 맞춤형 치료 전략 개발에 활용됩니다.

3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

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