박테리아 당단백질을 위한 비특이적 단백질 분해 기반 글리코믹스 전략

요약

본 연구는 프로나제 E 분해, 과메틸화 및 질량 분석 분석의 조합에 의한 당단백질의 당체학 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 박테리아 N-글라이칸을 포함한 모든 유형의 N-결합 글라이칸을 분석할 수 있습니다.

초록

단백질 당화(glycosylation)는 가장 일반적이고 복잡한 번역 후 변형(post-translational modification) 중 하나입니다. 글라이칸의 특정 역할, 글리칸 구조 간의 관계 및 단백질 기능에 대한 영향 간의 관계를 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 글라이칸 분석을 위한 일반적인 방법은 엑소글리코시다아제 절단을 사용하여 펩타이드-N-글리코시다아제 F(PNGase F)를 사용하여 당단백질 또는 글리코펩타이드에서 N-결합 글라이칸을 방출하는 것입니다. 그러나 박테리아의 글라이칸-단백질 연결은 다르며 박테리아 당단백질에서 글리칸을 방출하는 데 사용할 수 있는 효소는 없습니다. 또한 유리 글리칸은 포유류 세포, 박테리아, 효모, 식물 및 어류에서도 설명되었습니다. 이 논문에서는 표적 단백질에 부착되지 않은 아스파라긴(Asn) 결합 및 유리 글라이칸을 검출하여 Campylobacter jejuni의 N-결합 당화 시스템을 특성화할 수 있는 방법을 제시합니다. 이 방법에서 C. jejuni의 총 단백질은 효소 대 단백질 비율이 더 높고(2:1-3:1) 배양 시간이 더 긴 Pronase E(48-72시간)로 분해되었습니다. 생성된 Asn-글리칸 및 유리 글리칸을 다공성 그래파이트 탄소 카트리지를 사용하여 정제하고 과메틸화하고 질량 분석법으로 분석했습니다.

서론

단백질 N-글리코실화(protein N-glycosylation)는 진핵생물에서 가장 일반적이고 복잡한 번역 후 변형(post-translational modification) 중 하나입니다¹. N-글리칸은 단백질 접힘에 필수적인 역할을 하며 생합성 트래픽에서 단백질 분류에도 영향을 미칩니다². 질량분석법은 엑소글리코시다아제 절단(당체학)에 의해 방출되는 글라이칸 분석에 널리 사용되었습니다. 나머지 탈글리코실화 펩타이드(glycoproteomics)는 진핵생물에서 글리코실화 펩타이드의 서열을 확인하는 데 일반적으로 사용되어 왔습니다³. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에서 N-결합 글라이칸의 확인은 N-글리코실화가 진핵생물 ^4,5,6,7,8에 국한되지 않음을 시사했습니다. 그러나....

프로토콜

1. C. jejuni 11168H의 배양 및 총단백질 추출

참고: C. jejuni 11168H는 NCTC 11168¹²의 hypermotile clonal derivative이다.

1. 세포 펠릿(약 0.15g, NCTC)을 약 5mL의 Mueller-Hinton 배양 배지로 재수화하여 세포 배양을 시작합니다. 기본 육수 튜브를 몇 방울 떨어뜨려 Mueller-Hinton 한천 플레이트를 접종합니다. 37 ° C에서 18 시간 동안 미세 호기 성 대기, 즉 5 % O₂, 10 % CO₂ 및 85 % N₂ 에서 배양합니다.
2. 세균성 잔디밭에 뇌심장주입(Brain Heart Infusion, BHI) 육수 1mL를 수확합니다. BHI 육수로 수확물을 약 1 x 10⁵ c.f.u./mL에 도달하도록 희석합니다. 37°C의 미호기성 분위기에서 진탕(100rpm)으로 18시간 동안 세포를 성장시킵니다.
3. 플레이트를 얼음 위에 올려 10분 동안 세포를 식힌 후 ....

결과

프로나제 E 분해와 과메틸화의 조합에 기초한 방법은 C. jejuni 11168H의 총 단백질 추출물에서 N-글리칸 분석에 적용되었습니다. 그림 1은 실험 절차의 흐름도를 보여줍니다. 일반적인 소화에서 효소와 당단백질의 비율은 1:100에서 1:20 사이로 설정되었습니다. 여기서, 단백질에 대한 Pronase E의 비율을 2 : 1-3 : 1로 증가시키고 더 긴 소화를 사용하여 37 ° C에서 48 시간 동안 배양하여 배기 소화를 얻었습니다. 그런 다음 배기 가스 소화에서 Asn-glycans를 PGC로 정제하고 일상적인 DMSO-NaOH 접근법으로 과메틸화했습니다. 과메틸화 Pronase E 분해물의 MALDI-MS 분석은 그림 2에 나와 있습니다. 세 번의 과메틸화 반응 시간, 즉 5분, 10분 및 20분을 조사했습니다. 얻어진 MS 스펙트럼은 Protonase E 분해와 과메틸화의 조합.......

토론

이 보편적 당체학(universal glycomics) 전략을 구현하기 위한 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 배기 가스 소화를 완료하는 것입니다. 이 방법은 Pronase E 분해 완료에 크게 의존합니다. 따라서 긴 소화 시간과 높은 효소 대 단백질 비율을 사용하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 Pronase E/단백질에 대해 2:1-3:1의 비율과 48시간의 배양 시간을 사용하는 것이 좋습니다. 이 제안 된 배기 소화는 단일 아미노산을 주요 구성 요소로 하는 글라이칸을 생성한다는 것이 입증되었습니다¹⁰. 배기 디스제스트의 생성물은 PGC 카트리지로 정화해야 합니다. 그것은 글리칸뿐만 아니라 소화되지 않은 효소도 보유하고 있었습니다. 그러나 효소 단백질은 높은 소수성으로 인해 카트리지에서 용출되지 않습니다.

두 번째 중요한 단계는 메틸화의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2,5-디하이드록시벤조산(DHB),	시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)	149357
2-프로판올	Fisher Scientific(캐나다 온타리오주 오타와)	AA22906K7
4000 Q-Trap	AB Sciex(캐나다 콩코드)		질량분석기
4800 MALDI-TOF/TOF	Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터시티)		질량분석기
아세토니트릴( ACN)	Fisher Scientific(캐나다 온타리오주 오타와)	A996-4
Brain Heart Infusion(BHI) 육수	Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스)	5121
C18 Sep-Pak 카트리지	Waters(매사추세츠주 밀포드).
클로로포름	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	CX1054
Difco	Fisher Science (Ottawa, Ontario, Canada)	DF0037-17-8	Fisher Science
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	276855
Eppendorf tube	Diamed (Missisauga, Ontario, Canada)	SPE155-N
빙하 아세트산 산	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A6283
메탄올	Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada)	A544-4
메틸 요오드화물	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	289566
PGC 카트리지	Thermo Scientific (Waltham, MA)	60106-303	다공성 흑연 탄소
Pronase E	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	7433-2
단백질 분석 키트	Bio-rad(캐나다 온타리오주 미시소거	5000001
냉장 진공 농축기	Thermo Scientific(매사추세츠주 월섬)	SRF110P2-230
수산화나트륨	시그마-알드리치(미주리주 세인트루이스)	367176
초음파 처리기	Mandel Scientific(캐나다 온타리오주 구엘프)	XL 2020
트리플루오아세트산(TFA)	Fisher Scientific(캐나다 온타리오주 오타와)	A11650
Tris-HCl	Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스)	T3253

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