Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

S1PRS'nin mürettebat, EM manipülasyonları ve GI inhab durumu A M P A tarafından aktivasyonu ve ilaç yeniden hesaplama ruh hallerini ele aldık ve S1PRS'yi sağlam bir şekilde hedefleyen bir ilaç geliştirmek için daha az önemli bir temel oluşturduk GP ZR stimülasyonu veya yerleşiminin magnisistik alt resimlerini virülize etmeyi mümkün kılan ilerlemeler ve T BCR hedefli ilaç üretimi için normal bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağladık. Numunenin kalitesi, doğru EM deneyindeki her şeyin temelidir. Basit hazırlık için gerekli faktörler arasında SF hattı satışının çeşitli ürün durumu ve bir N g konsantrasyonu Prosedürün gösterilmesi, benim seviyemden bir yüksek lisans öğrencisi olan Heli Wang olacaktır.

Protein saflaştırma için bu parmak sahnesini bir fosfat reseptörü veya S bir P R S G protein kompleksi çözeltisini, dört santigrat derecede dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında S E C tamponu ile önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kromatografisine veya S E C jel filtrasyon kolonuna yükler. Toplanan fraksiyonları kriyo elektron mikroskobu için kullanmak için, dört santigrat derecede 1.300 XG'de 100 kilodaltonluk bir kesme yoğunlaştırıcısı kullanarak konsantre edin. Parçacıkların ön sınıflandırmasında 2B sınıflandırma için veri işleme sırasında, Güvene Güvenin yazılımındaki 2B sınıflandırma işlevini seçin ve G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklatın.

Ardından particles.star'ı seçin. Ardından, optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını 100 ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın. Hesaplama seçeneğinde, havuza alınmış parçacık sayısını 10 olarak ayarlayın ve parçacığı çizik kopyalama dizini alanına hızlı, hızlı bir yerel sürücüden dizini girin.

Daha hızlı işleme için, kullanılmış GPU hızlandırma için evet'i seçin. İyi 2B sonuçların şablon olarak alt küme seçimi için, alt küme seçim işlevinin GÇ seçeneğine gidin ve model.star'dan seçilen sınıfların sağına göz atın. Ardından, run_it025_model'yi seçin.

giriş olarak yıldız verin ve açılır pencerede çalıştır'a tıklayın, görüntüleri sıralayın ve ters sıralayın. Ardından ekrana tıklayın. Otomatik toplama işlevinin referansı için referans olarak iyi temsili 2D sonuçları seçtikten sonra, Sağ tıklayın ve seçilen sınıfları kaydet'i seçin.

Şablonu otomatik toplamanın ikinci turunda kullanmak için, otomatik toplama işlevinin GÇ seçeneğine gidin. Otomatik seçim için giriş mikrograflarının sağına göz at'ı tıklatın ve micrographs.star'ı seçin. Ardından 2D referansların sağına göz atın ve class_averages.star'ı seçin.

Ayrıca, Gaussian'da leplossian için hayır'ı seçin veya kullanın. Ardından, kablo alt çizgi sonekini kullanarak parçacık çıkarma işlemini gerçekleştirin auto pick.star alt çizgisini kullanın. Parçacıkları kullanarak 2B sınıflandırma gerçekleştirin.

yıldız, ardından alt küme seçimi kullanılarak çalıştırma alt çizgisi sıfır 20 five_optimizer. star Parçacık çıkarma için, IO seçeneğinde mikrograf yıldız dosyasının sağına gözat'ı tıkladıktan sonra mikrografları seçin. yıldız ekleyin ve rafine edilmiş parçacıklar için evet'i seçin veya yeniden ayıklayın.

Rafine parçacıklar yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklattıktan sonra, parçacıkları seçin. İlk 3B model ve referans haritası oluşturmak için yıldız, G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağındaki 3B başlangıç modeline göz atmayı tıklayın ve önceki particles.star'ı seçin. Ardından optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını bire ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.

3B sınıflandırma ve parçacıkları seçtikten sonra bir ön 3B harita oluşturmak için. daha önce gösterildiği gibi yıldız, referans haritasının sağına göz atın ve ilk alt çizgi modeli nokta mrc'yi seçin. Ardından, en iyileştirme seçeneğinde, sınıf sayısını dört ila altı ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.

Maske oluşturmak için, GÇ seçeneğinde giriş olarak iyi bir 3B eşleme seçtikten sonra, ilk ikili eşleme eşiğini 0,05 olarak ayarlayın ve ikili eşlemeyi bu kadar piksele üç piksele genişletin. Ardından, maske seçeneğine gidin ve ayarlayın. Bu kadar piksele sekize yumuşak kenar ekleyin.

Sonraki işlemler için Trino Spark yazılımını açın, yeni bir çalışma alanı oluşturun ve ilk iş için iş oluşturucuya tıklayın. Parçacık yığınını içe aktarmak için, parçacık meta yolu alanına parçacık yolunu ve parçacık veri yolu alanına film yolunu girin. Ardından, birim veri yolunda daha önce oluşturulan en iyi 3B birimin yolunu girerek ve içe aktarılan birimin türü için maskeyi seçerek 3B birimleri içe aktarın.

Düzgün olmayan arıtma için, daha önce oluşturulmuş içe aktarılan alt çizgi parçacıklarını, düzgün olmayan arıtmalar parçacıkları parçacığının girdisi olarak sürükleyin. İçe aktarılan alt çizgi hacmi, tekdüze olmayan iyileştirmeler hacmi hacminin girdisi olarak birinin altını çizin ve içe aktarılan alt çizgi maskesi, tekdüze olmayan iyileştirmeler maskesinin girdisi olarak bir alt çizgi maskesinin altını çizer. Maske. Ardından, işlemeye başlamak için Q'yu tıklatın ve iyi bir çözüm elde etmek için yordamı tekrarlayın.

S1PRGI 3D harita. Plazmid yapımı ve geçici transfeksiyon için hazırlıktan sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon reaktif tamponuna iki mikrogram hazırlanmış DNA ekleyin. 10 saniye boyunca vorteks yaparak karıştırın ve kullanmadan önce karışımı kısa bir süre döndürün.

Dört mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi vorteks ve eğirme ile karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon karışımını CHOK bir hücre içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça bırakın ve plakayı veya iyice karıştırın. Dört ila altı saatlik inkübasyondan sonra, plakayı inkübatöre geri döndürmeden önce transfeksiyon ortamını F 12 ortamı ve% 10 fbs'den oluşan hücre büyüme ortamı ile değiştirin.

Hücrelerin transeksiyon hasadından 24 ila 48 saat sonra, hücreleri D lusiferyen potasyum tuzu ile bir SA tamponunun üç mililitresinde askıya alın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, hafifçe karıştırılmış 96 kuyucuklu bir plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Floresan sinyal tayini için, İlk olarak, D M S O.'da siponimod'un 10 milimolar stok çözeltilerini hazırlayın.Daha sonra 25 mikromolar forskalin içeren H B S S tamponunda seri seyreltme yapın ve hücreleri 30 dakika boyunca bu agonist çözeltinin çeşitli konsantrasyonlarında 10 mikrolitre ile uyarın.

Ardından, algılama yöntemi için lüminesansı seçerek bir mikroplaka okuyucudaki lüminesans sinyalini sayın. Okuma türü için uç nokta ve ilgili yazılımdaki optik türü için lüminesans fiber. Ayrıca, optik kazancını 255 olarak ayarlayın.

Ardından, elde edilen floresan sinyal değerlerini bir elektronik tablo programına aktarın ve doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygun doz yanıtı işlevini kullanarak verileri işleyin. S1PRS GI kompleksi, SDS sayfası tarafından doğrulanan boyut dışlama kromatografisi ile başarıyla saflaştırılabilir. Ayrıca, bu çalışmada izlenen elektron mikroskobu protokolü, açık ve iyi tanımlanmış 2D sınıfları ve düşük kaliteli parçacıkları olan S1PRSGI parçacıkları arasında ayrım yapmada etkili olmuştur.

Ayrıca, iyi bir çözünürlüğe sahip S1PR3 GI'nin elektron mikroskobu haritası, düzgün olmayan arıtma yoluyla kürk kabuğu korelasyonu ile üretilebilir. Yapısal analizden sonra, S bir P R üç için fonksiyonel testler, C H O K bir hücrenin reseptör ve sensör plazmidleri ile transfeksiyonu ile yapıldı, bu da reseptör plazmidinin sensör plazmidine oranının bir ila üç arasında optimum sonuçlar verdiğini ortaya koydu. Bununla birlikte, sonuçlar heck 2 93 hücrelerinde daha az gerçekçiydi Bu işlemede, parçacık bölümündeki algoritmaların seçimi ve 2B ve 3B sınıflandırma bölümü, özellikle sızıntıları ve ecf'leri modellemek için MPS G protein komplekslerini çözmek için önemlidir.