Name: フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶフルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞のT細胞受容体誘導性カルシウム流入解析法。細胞分離不要でサブセットと表面フェノタイプを同時評価し、免疫学研究の効率を向上させる。

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R01AI132419, CU |AMC ImmunoMicro Flow Cytometry共有リソース、RRID:SCR_021321、AuroraおよびSpectroFloソフトウェアでのフルスペクトルサイトメトリー分析の継続的な議論を提供してくれたCytekの同僚に感謝します。図は BioRender.com で作成されました。

<ol><li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation%3A+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li>
<li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+calcium+mobilization+study+%28flow+cytometry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).</li>
<li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).</li>
<li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+%28ITK%29+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+%28RLK%29+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li>
<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
<li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase%2C+Itk%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022).</li>
<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022).</li>
<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

著者は宣言する競合する利益を持っていません。

このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリー7,8を使用して滴定されたIndo-1レシオメトリックインジケーター色素をロードした初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を測定するために設計された最適化されたアッセイについて説明しています。フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してカルシウムフラックスアッセイを実施する利点は、Indo-1蛍光の評価と組み合わせて表面細胞マーカー染色をマルチプレックスできることです。フルスペクトルフローサイトメトリーには、重なり合った色素を使用できるため、パネルで使用できるマーカーの数が増えるという利点があります。これは、フルスペクトルフローサイトメーターが、1つの蛍光色素専用の検出器を持つのではなく、分析された各サンプルの検出器のアレイにわたって放出されるすべてのレーザー光を収集するという事実によるものです。各蛍光の全スペクトルを使用することで、アッセイの感度を高めることができ、バンドパスフローサイトメーターで収集した場合にシグナルが重複するスペクトル固有の蛍光色素を同定する手段が...

T細胞受容体(TCR)誘導性カルシウム流入は、T細胞活性化の有用な尺度であり、T細胞の集団がTCRシグナル伝達経路1の近位ステップで応答を障害しているかどうかを判断するために頻繁に使用されます。カルシウム流入の測定は、一般に、T細胞を1つまたは1対の蛍光カルシウム指示色素で予め標識し、次いでTCR架橋後にフローサイトメトリーを用いて蛍光シグナルをリアルタイムで調べることによって行われる2,3,4。レシオメトリックカルシウム色素であるインド-1は、カルシウム結合に依存する2つの異なる波長でピーク発光するUVレーザーによって励起され5、生リンパ球におけるカルシウム応答のフローサイトメトリー分析に一般的に使用される指標色素です。Indo-1の発光プロファイルは非常に広いため、Indo-1評価とバンドパスフローサイトメトリーによる複数の細胞表面マーカーの同時分析を組み合わせることは困難な場合があります。この制限により、カルシウム応答のフローサイトメトリー分析の利用は、T細胞の事前に精製された集団または限られた細胞表面分子のセットによって同定された集団に制限されます。
バンドパスフローサイトメトリーを使用して初代リンパ球の不均一な集団に対するカルシウム応答を測定することの限界に対処するために、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してIndo-1蛍光を測定するためのプロトコルが開発されました。この方法では、フルスペクトルフローサイトメトリーの柔軟性の高い機能を利用して、細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでIndo-1をマルチプレックス化することができます。従来のフローサイトメトリーよりもフルスペクトルフローサイトメトリーを使用する利点は、蛍光シグナルを高度に重なり合う色素から区別できるため、各サンプルで同時に評価できる表面マーカーの数が増えることです。従来のフローサイトメトリーはバンドパスフィルターを使用し、検出器システム6あたり1つの蛍光色素に制限されています。フルスペクトルフローサイトメトリーは、5レーザースペクトルフローサイトメトリーシステム上の64個の検出器を使用して、蛍光色素の全スペクトルにわたってシグナルを収集します7,8。さらに、フルスペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメーター8に存在する光電子増倍管検出器と比較して感度が向上したAPD(アバランシェフォトダイオード)検出器を利用します。したがって、このアプローチは、カルシウム色素標識の前に特定のT細胞集団を単離する必要がないため、末梢血単核細胞やマウス二次リンパ器官細胞懸濁液などの不均一な細胞集団に最適です。代わりに、データ収集後の細胞表面マーカー発現プロファイルとフローサイトメトリーゲーティングを使用して、関心のある各集団におけるカルシウム応答を評価できます。このレポートで示されているように、Indo-1は8つの蛍光色素結合抗体と容易に組み合わせることができ、合計10のユニークなスペクトルシグネチャが得られます。さらに、この方法は、先天的に異なるマウス系統の細胞の混合物に容易に適用することができ、遺伝子標的マウス株からのものと比較して、野生型T細胞におけるカルシウム応答の同時解析を可能にする。

<table><tbody><tr><td>12ウェルTC処理プレート</td><td>細胞治療</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50mL 円錐形</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>50 mL ポリプロピレン遠心分離管 キャップ付き</td></tr><tr><td>5mL ポリステレンフローチューブ</td><td>コーニング</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5mL シリンジ</td><td>BDシリンジ</td><td>309646</td><td>プランジャーのみ使用 sheith は廃棄されます</td></tr><tr><td>70uM フィルター</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Spectral Flowcytometer</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath Beads</td><td>coleparmer</td><td>アイテム # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramer APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>とんぼ</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>Formal Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools 鉗子</td><td>McKesson</td><td>#487593</td><td>組織鉗子マッケソンアドソン4-3 / 4インチ長さオフィスグレードステンレス鋼非滅菌非ロッキングサムハンドル1 x 2歯</td></tr><tr><td>解剖ツールハサミ</td><td>McKesson</td><td>#970135</td><td>手術はさみMcKesson Argent&trade; 4-1 / 2インチ外科グレードステンレス鋼指輪ハンドルストレートシャープチップ/シャープチップ</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>フィッシャー</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ハイクロンド</td><td>SH30071.03</td><td>AE29165301ロット</td></tr><tr><td>FlowJoソフトウェア</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-AMエステル染料</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>カルシウムローディング染料&nbsp;</td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>ミリポア</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>ライブ/デッドゴースト540</td><td>とんぼ</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ1.7mL</td>ライト<td>ラボ</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688精製</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD16 / CD32(FCシールド)(2.4G2)</td><td>とんぼ</td><td>70-0161-M001</td><td>FC ブロック</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td></td> <td>1875093&nbsp;+ フェノールレッド</td></tr><tr><td>RPMI フェノールフリー</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&nbsp;-フェノールレッド</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アレグラ612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&β;PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gamma;/&delta;Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu 試薬パック</td><td></td><td>製品番号:C06019</td><td>Tripan</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Brand ドライバス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスt細胞におけるt細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T細胞受容体刺激に応答するカルシウム流入は、T細胞シグナル伝達の一般的な尺度である。バンドパスフローサイトメトリーによるカルシウムシグナル伝達を評価するために、いくつかのカルシウム指示色素が開発されています。このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用して初代マウスT細胞のカルシウム応答を測定するように設計されています。全脾細胞は、細胞表面分子に対する蛍光色素結合抗体のパネルとともに、レシオメトリックカルシウム指示色素Indo-1で標識されています。フルスペクトルフローサイトメトリーの機能を活用することで、Indo-1と組み合わせて幅広い細胞表面染色剤を利用するためのプラットフォームが提供されます。次いで、T細胞受容体を刺激する抗CD3抗体の添加前後の37°Cで細胞をリアルタイムで分析する。スペクトルシグナルを混合解除した後、カルシウム結合とカルシウムフリーのインド-1の比率が計算され、脾細胞のゲート集団ごとに経時的に視覚化できます。この技術は、複数の細胞集団におけるカルシウム応答の同時解析を可能にすることができる。

マルチプレックス表面染色を有するIndo-1レシオメトリック色素を用いて初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を評価する実験ワークフローを 図1に示す。マウス脾細胞を回収し、単一細胞懸濁液に加工した後、細胞をIndo-1 AMエステルで染色し、蛍光色素結合抗体で表面染色します。色素の装填と抗体染色が完了したら、リンパ球サンプルを生物学的温度(37°C)まで温めます。次に、分析前にサンプルを選別することなく、目的の個々の細胞タイプをゲーティングした後、Indo-1蛍光のフルスペクトルフローサイトメトリーを使用してサンプルを分析します。フルスペクトルフローサイトメーター内でアバランシェフォトダイオード(APD)検出器を使用するには、nm単位で測定されたバンドパスフィルター波長からのピーク発光波長をAPD上のそれぞれのチャネルに変換する必要があります。図2に示す表はガイドラインを示していますが、インド-1の 2 つの蛍光シグネチャ(カルシウム結合とカルシウムフリー)に最適な検出器は経験的に決定する必要があります。これは、イオ...

T細胞シグナル伝達の尺度であるカルシウム流入は、T細胞受容体刺激に対する応答を分析するための効果的な方法です。Indo-1を細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでマルチプレックス化するためのこのプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーの非常に柔軟な機能を利用しています。

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

このプロトコルにより、研究者は初代T細胞のカルシウム応答を同時に測定し、それらのサブセットと表面表現型を評価することができます。この技術の主な利点は、カルシウム応答を調べる前に細胞の特定のサブセットを単離する必要がないことです。はじめに、50マイクログラムのインド1 AMを含むバイアルに50マイクロリットルのDMSOを加えることにより、インド-1 AMの1マイクロリットルあたり1マイクログラムのストック溶液を調製します。ストック溶液を適切な量のcRPMIとミリリットルあたり6マイクログラムの濃度に希釈します。培地を摂氏37度の水浴に入れる。次に、この培地を使用して、事前に調製した細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、1ミリリットルあたり5〜600万個の細胞を取得します。次に、12穴組織培養プレートに、実験条件ごとに1ウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を添加する。Indo-1色素を負荷した細胞にEGTAを添加することにより、カルシウムフリーのIndo-1の単一染色対照サンプルを調製します。蛍光色素やIndo-1色素を含まない生物学的陰性対照用のウェルを準備します。フローサイトメーターで色素を装填した細胞懸濁液に50マイクロモルの濃度でイオノマイシンを添加することにより、Indo-1ポジティブコントロールを調製します。また、抗体結合蛍光色素を使用して、追加の細胞集団のための単一染色コントロール用のウェルを調製します。次に、100万細胞あたり2マイクログラムのFC受容体遮断抗体を追加し、15分ごとにタップしてプレートを45分間インキュベートし、細胞を再懸濁します。インキュベーション後、プレートから全容量の細胞を混合して取り出し、それを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに加える。遠心分離機で上清をデカントする。細胞を1ミリリットルの予め温めたcRPMIで洗浄したら、再度ペレット化し、上清をデカントする。細胞を1ミリリットルのcRPMIに再懸濁し、各チューブをインキュベートし、チューブの上部をガス交換のためにわずかに開いたままにして、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化を可能にします。次に、すべてのユーザー定義蛍光色素結合抗体のマスターミックスを調製し、それを1ミリリットルの細胞容量の休止細胞に加えます。安静後、細胞をペレット化し、摂氏4度に冷却した1ミリリットルのcRPMIに再懸濁してペレットを洗浄する。この手順を繰り返し、チューブを氷の上に置きます。キャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンフローチューブを使用して、個々のサンプルを500マイクロリットルのフェノールレッドフリーcRPMIに再懸濁します。カルシウムフラックス分析を使用して温度を維持するには、小さな水浴にバスビーズを加えてビーズバスを準備し、摂氏37度まで温めます。50ミリリットルのクロニクルチュ

analysis-t-cell-receptor-induced-calcium-influx-primary-murine-t

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T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

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学ぶフルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞のT細胞受容体誘導性カルシウム流入解析法。細胞分離不要でサブセットと表面フェノタイプを同時評価し、免疫学研究の効率を向上させる。

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

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