Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie

Die Technik ermöglicht die bestätigende Diagnose von Prionenerkrankungen durch die Technik PrP-Scrapie in Geweben, wobei die PrP-Scrapie-Typen und -Verteilung analysiert werden, um die strafende Abweichung vom bekannten PrP-Scrapie-Ablagerungsprofil zu bewerten. Die Technik ist standardisiert und verwendet spezifische Antikörper gegen PrP-Scrapie, die die Visualisierung der PrP-Scrapie-Ablagerung in Geweben ermöglichen. Die Technik gibt auch Aufschluss über den neuroanatomischen Bereich und den Zelltyp.

Legen Sie zunächst die Objektträger mit den Gewebeschnitten in einen Edelstahl-Färbekorb. Stellen Sie den Korb in ein Xylolbad. Nehmen Sie den Korb nach drei Minuten heraus und tauchen Sie ihn erneut ein.

Um Xylol zu entfernen und die Abschnitte zu rehydrieren, tauchen Sie den Korb in ein absolutes Ethanolbad. Nehmen Sie den Korb nach drei Minuten heraus und tauchen Sie ihn erneut ein. Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft, bevor Sie sie eine Minute lang in ein 90%iges Ethanolbad legen.

Anschließend wird der Abschnitt für eine weitere Minute in ein 70%iges Ethanolbad überführt. Bewegen Sie den Objektträgerkorb bei jeder Ethanolbadbehandlung zweimal vorsichtig und entleeren Sie den Korb vor dem nächsten Transfer. Übertragen Sie den Korb für eine Minute in ein 50%iges Ethanolbad.

Tauchen Sie die Gewebeschnitte vorsichtig 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 98%ige Ameisensäure. Spülen Sie die Abschnitte fünf Minuten lang in Leitungswasser und spülen Sie sie anschließend zweimal in destilliertem Wasser ab. Verwenden Sie einen Edelstahl-Färbebehälter in der Druckkammer, die mit 500 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt ist, um den 10-millimolaren Citratpuffer 20 Minuten lang bei 98 Grad Celsius vorzubehandeln.

Legen Sie zur Qualitätskontrolle ein Stück selbstklebendes Autoklaven-Indikatorband auf den Korb, um Temperatur und Druck zu überwachen. Sobald der Alarm anzeigt, dass das Gerät die Programmzeit und -temperatur erreicht hat, tauchen Sie den Korb mit Objektträgern ein. Starten Sie anschließend das Programm an der Druckkammer auf Sollwert 2 und notieren Sie den Anfangs- und Enddruck dieses Programms.

Zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase wird der Objektträgerkorb mit den Probenschnitten 30 Minuten lang in ein Bad aus 3%igem Wasserstoffperoxid in Methanol getaucht. Überbrücken Sie die Abschnitte fünf Minuten lang unter fließendem Wasser Tauchen Sie die Abschnitte nach dem Abtropfen für weitere fünf Minuten in Tris-gepufferte Kochsalzlösung. Legen Sie zur Immundetektion jeden Objektträger auf einen handelsüblichen Abdeckplattenhalter, der mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung vorbefeuchtet ist, wobei die Gewebeseite dem Halter zugewandt ist und die Objektträgerkanten mit den beiden unteren Punkten des Halters übereinstimmen.

Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Halten Sie den Diahalter zwischen Daumen und Zeigefinger. Halten Sie einen Finger oben auf dem Objektträger und den anderen auf der Unterseite des Halters und platzieren Sie dann die Baugruppe in der Galerie des Systems.

Um sicherzustellen, dass das Set gut montiert ist, füllen Sie die Vertiefung zwischen dem Objektträger und dem Halter mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, ohne sie zu überlaufen. Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass etwa 80 Mikroliter Tris-gepufferte Kochsalzlösung zwischen dem Halter und dem Objektträger zurückgehalten werden müssen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.

Verringern Sie die Hintergrundfärbung vor der Behandlung mit dem primären Antikörper, indem Sie die Objektträgerproben 30 Minuten lang mit 20% normalem Serum derselben Spezies wie der sekundäre Antikörperwirt in Tris-gepufferter Kochsalzlösung vorinkubieren. Ohne die Schnitte zu waschen, geben Sie 200 Mikroliter der primären Antikörperlösung direkt in jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Abschnitte zu waschen, füllen Sie die Vertiefungen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung und warten Sie fünf Minuten.

Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Als nächstes verdünnen Sie den biotinylierten sekundären Antikörper in einer Konzentration von 1 bis 200 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 10% Pferdeserum. Reparieren Sie das erforderliche Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der zu behandelnden Abschnitte.

Tragen Sie 200 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung auf jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf. Wiederholen Sie nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur die Tris-gepufferte Kochsalzlösung. Für die Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplexperoxidase bereiten Sie das Reagenz 30 Minuten vor Gebrauch vor und tragen Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung des Objektträgerhalters auf.

Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie den Plattenhalter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Ausmaß der unspezifischen Immunmarkierung bei bekannten transmissiblen transmissiblen spongiformen Enzephalopathien-negativen Kontrolltieren wurde bestimmt, um die spezifische abnorme Immunmarkierung von Prionproteinen richtig zu interpretieren. Es wurde festgestellt, dass die Nicht-Ziel-Markierung durch Anti-PrP-Antikörper als diskrete intraneuronale feinpartikuläre Färbung, unregelmäßige feine lineare Fäden der Färbung im Neuropil, diffuse nicht-partikuläre Markierung in einigen Bereichen der grauen und weißen Substanz und diffuse zytoplasmatische Markierung von Neuronen auftritt.

Die Tabelle fasst die Beschreibung der immunmarkierten abnormen Prionproteintypen zusammen, die bei boviner spongiformer Enzephalopathie, klassischer und atypischer Traberkrankheit und einer chronischen Auszehrungskrankheit von Hirschen beobachtet wurden, für eine positive Diagnose und festgelegte Kriterien für negative, nicht schlüssige und ungeeignete Ergebnisse. Alle Schritte sind sehr wichtig. Der pH-Wert der Lösungen und die Raumtemperatur sind wichtige Merkmale für den Erfolg dieser Technik.

Die Entwicklung der Immunhistochemie zum Nachweis sowohl der PrP-Traberkrankheit als auch des Zelltyps kann Informationen über jede Zelle liefern, die an der primären Pathogenese beteiligt ist.