Name: Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung von Pankreasduktalen Adenokarzinomzellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Lentivirus. Diese Methode ermöglicht die Etablierung stabiler iPSC-Linien zur Untersuchung der Krebsprogression.

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A.S. und J.K. danken Cancer Research UK und OHSU für die Finanzierung (CRUK-OHSU-Projektpreis C65925/A26986). A.S. wird durch einen MRC-Karriereentwicklungspreis (MR/N024028/1) unterstützt. A.A. wird durch ein Ph.D.-Stipendium (Scholarship Ref. 1078107040) der King Abdulaziz City for Science and Technology finanziert. J.K. wird durch den MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) und den Knight CEDAR Grant (68182-933-000, 68182-939-000) finanziert. Wir danken Prof. Keisuke Kaji für die freundliche Bereitstellung der Reprogrammierungsvektoren pSIN4-EF1a-O2S und pSIN4-CMV-K2M. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.

Reprogrammierung von PDAC- und Pankreaszellen in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Um die Verwendung der iPSC-Reprogrammierung zur Untersuchung des Krebsverlaufs zu erleichtern, wurde ein robustes Protokoll für die Reprogrammierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen entwickelt. Die Reprogrammierung von Krebszellen in Pluripotenz hat sich bisher als sehr schwierig erwiesen, da nur wenige Studien erfolgreich iPSCs aus Krebszellen erzeugt haben 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 </su...

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Malignome, und eine frühzeitige Diagnose bleibt aufgrund der asymptomatischen Natur der Krankheit eine Herausforderung. Die Mehrheit der PDAC-Patienten wird im fortgeschrittenen metastasierenden Stadium diagnostiziert, wenn nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen 1,2. Dies ist hauptsächlich auf den Mangel an zuverlässigen Biomarkern für die früheren Stadien zurückzuführen, z. B. solche, die bequem als Proteine nachgewiesen werden könnten, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
PDAC kann sich sehr früh während seines Fortschreitens ausbreiten, und eine bessere Prognose wurde mit der Krebsfrüherkennung in Verbindung gebracht, wenn PDAC in der Bauchspeicheldrüse lokalisiert ist3. Bei weniger als einem Zehntel der PDAC-Patienten wird jedoch eine günstige Prognose diagnostiziert, die eine chirurgische Resektion ermöglicht. Nichtsdestotrotz sind die wenigen mit resezierbaren Tumoren auch anfällig für ein Wiederauftreten des Tumors innerhalb von 12 Monaten4.
In den letzten fünf Jahrzehnten wurden bemerkenswerte Verbesserungen bei den Operationstechniken, der Patientenversorgung und den Behandlungsmodalitäten erzielt 5,6. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei chirurgisch resezierten PDAC-Patienten ist jedoch kaum auf 17% gestiegen. Dies ist jedoch immer noch besser als bei nicht resezierten Patienten, die nahezu unverändert geblieben sind (0,9 %)4,7. Die Chemotherapie ist die einzige andere alternative PDAC-Behandlung. Diese Option ist jedoch sehr begrenzt, da die große Mehrheit der PDAC-Patienten eine starke Resistenz gegen Chemotherapeutika wie Gemcitabinaufweist 7,8. Andere Medikamente, wie Erlotinib, stehen nur einer kleinen Gruppe von PDAC-Patienten mit spezifischen Mutationen zur Verfügung, von denen die meisten eine Erlotinib-Resistenz aufweisen9. Die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Chemotherapie bei den meisten PDAC-Patienten verbunden sind, sind ein weiterer Nachteil dieser Behandlung10. In jüngster Zeit haben vielversprechende Strategien gezeigt, dass Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und niedermolekulare Kinase-Inhibitoren (SMKIs) bei der Behandlung von PDAC wirksam sein können, aber ein dauerhaftes Ansprechen auf diese zielgerichteten Therapien bleibt auf eine Minderheit der Patienten beschränkt11,12. Insgesamt kann die Entdeckung von PDAC-spezifischen frühen Biomarkern neue Wege für eine frühzeitige Diagnose und Behandlung ebnen.
PDAC entwickelt sich aus Vorläuferläsionen von intraepithelialen Pankreasneoplasien (PanIN), die aus nicht-invasiven Epithelproliferationen des Pankreasgangs resultieren13,14. Während die Bildung von PanIN durch Onkogenmutationen wie KRAS initiiert wird, sind für die Progression zu PDAC zusätzliche genetische und epigenetische Veränderungen erforderlich. Es wurde prognostiziert, dass das Fortschreiten von PanIN durch die verschiedenen Stadien in die invasive PDAC etwa 10 Jahre dauert 13,15,16,17. Dieser Zeitrahmen bietet eine großartige Gelegenheit, von einer frühen PDAC-Diagnose zu profitieren. Daher wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt, um Tumor-Xenotransplantat-Tiermodelle und Organoidkulturen zur Untersuchung der PDAC-Progression zu etablieren 18,19,20,21. Diese Modelle waren sehr nützlich für die Untersuchung der invasiven Stadien der PDAC, wenn auch nicht für den Übergang von den frühen PanIN-Phasen. Es ist daher wichtig, experimentelle Modelle zu entwickeln, die den frühen Verlauf von PanIN-Stadien rekapitulieren können, um die Entdeckung von Biomarkern zur Früherkennung zu ermöglichen.
Die Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung der vier Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC (OSKM) hat das Ausmaß der zellulären Plastizität veranschaulicht22. Die Plastizität von Krebszellen ist gut dokumentiert, und die Reprogrammierung menschlicher Krebszellen in iPSCs wurde erfolgreich eingesetzt, um Zellen in ihren ursprünglichen zellulären Zustand zurückzusetzen und viele der epigenetischen Beleidigungen zu entfernen, die sich während des Fortschreitens der Krebserkrankung angesammelt haben 23,24,25,26,27,28,29. Die Möglichkeit, diese Reprogrammierungsstrategie zur Manipulation der Krebszellidentität zu nutzen, ist daher bei der Behandlung von Krebs vielversprechend30,31. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Differenzierung von iPSCs, die von PDACs abgeleitet sind, die PDAC-Progression durch die frühen PanIN-Stadien rekapitulieren kann32. Durch die Identifizierung von Genen und Signalwegen, die für die frühen bis mittleren Stadien der PDAC spezifisch sind, wurden Kandidaten-Biomarker identifiziert, die klinisch für die frühe PDAC-Diagnose verwendet werden können32,33. Die Biomarker, die mit einer einzigen iPSC-Linie entdeckt wurden, zeigten jedoch bei der Mehrheit der PDAC-Patienten eine begrenzte Abdeckung32. Die Herausforderungen bei der Generierung von iPSC-Linien von anderen PDAC-Patienten haben die Entdeckung zuverlässigerer Biomarker verhindert. Dies ist auf viele technische Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Heterogenität der OSKM-Verabreichung, da nur ein kleiner Teil der menschlichen primären PDAC-Zellen alle vier Faktoren enthielt und erfolgreich auf die Reprogrammierung reagierte. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Reprogrammierung primärer PDAC-Zellen unter Verwendung einer effizienteren und konsistenteren dualen lentiviralen Verabreichung von OSKM vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Human-TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Hypophysenextrakt (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin aus Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, Typ-I-Lösung aus Rattenschwanz</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Abgeschlossenes definiertes K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Corning Spritzenvorsatzfilter</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen</td><td>von Corning Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>Day Impex&nbsp; Virkon Desinfektionsmittel Viruzide Tabletten</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD Transfektionsreagenz</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinelösung, Typ B, 2 % in H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes EGF-Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Protein (FGF-2/bFGF) (154 aa) Rekombinantes Protein, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Epithelzelllinie des Pankreasgangs (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF-Feederzellen</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Keratinozyten-Serum Freie Medien (KSFM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0,45 &mu; M Spritzen-Filtereinheit (steril)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (ATCC-Modifikation)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritzen zum Einmalgebrauch (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1x), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochlorid)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

umprogrammierung des duktalen adenokarzinoms der bauchspeicheldrüse zur pluripotenz

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Transkriptionsfaktoren wurde aus fast jedem differenzierten Zelltyp erreicht und hat sich für Forschung und klinische Anwendungen als sehr wertvoll erwiesen. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die iPSC-Reprogrammierung von Krebszellen, wie z. B. dem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), den invasiven PDAC-Phänotyp umkehrt und das Krebsepigenom außer Kraft setzt. Die Differenzierung von PDAC-abgeleiteten iPSCs kann die PDAC-Progression von ihrem frühen Pankreas-Intraepithelneoplasie-Vorläufer (PanIN) rekapitulieren und die molekularen und zellulären Veränderungen aufdecken, die früh während der PDAC-Progression auftreten. Daher können PDAC-abgeleitete iPSCs verwendet werden, um die frühesten Stadien von PDAC für die Entdeckung von diagnostischen Markern für die Früherkennung zu modellieren. Dies ist besonders wichtig für PDAC-Patienten, die in der Regel in den späten metastasierenden Stadien diagnostiziert werden, da es an zuverlässigen Biomarkern für die früheren PanIN-Stadien mangelt. Die Reprogrammierung von Krebszelllinien, einschließlich PDAC, in Pluripotenz bleibt jedoch eine Herausforderung, arbeitsintensiv und variiert stark zwischen verschiedenen Linien. Hier beschreiben wir ein konsistenteres Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien unter Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren. Die resultierenden iPSC-Linien sind stabil und zeigen keine Abhängigkeit von der exogenen Expression von Reprogrammierungsfaktoren oder induzierbaren Medikamenten. Insgesamt erleichtert dieses Protokoll die Generierung einer breiten Palette von PDAC-abgeleiteten iPSCs, was für die Entdeckung früher Biomarker, die spezifischer und repräsentativer für PDAC-Fälle sind, unerlässlich ist.

Repräsentative Bilder, die die Morphologie von iPSC-Kolonien zeigen, die von PDAC-, BXPc3-, H6C7- und hFib-Zellen abgeleitet sind, sind in Abbildung 1 dargestellt. PDAC-iPSC-Kolonien begannen sich am 25. Tag der Reprogrammierung zu bilden. Robuste iPSC-Kolonien mit einer etablierteren ESC-ähnlichen Morphologie wurden am Tag 40 der Reprogrammierung identifiziert (Abbildung 1). In ähnlicher Weise begann die Bildung von BxPc3-iPSCs ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (PDAC) und normalen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Wir bieten ein optimiertes und detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, von der Vorbereitung des Lentivirus bis zur Etablierung stabiler iPSC-Linien.

Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Pankreaskrebs-Stammzellen (CSCs) können in vitro mit der Verankerungsunabhängigen Kugelkulturtechnik vermehrt werden, die ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der CSC-Biologie darstellt und als erster Schritt zur Entwicklung neuartiger CSC-Targeting-Therapien dienen kann. Hier wird die Methodik für die Erweiterung, Analyse und das Targeting von Pankreas-CSCs bereitgestellt.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Verfügbarkeit von somatischen SCs ist entscheidend für die regenerative Medizin Krankheit Modellierung und Einblick in SC Eigenschaften. Hier präsentieren wir experimentelle Strategien reprogram, in Vitro unterscheiden sich adulte Zellen in ihre entsprechenden erweiterbar gewebespezifische Stammzellen/Progenitor-Zellen durch die transiente Expression die transkriptionelle Coaktivator YAP.

De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Primäre acinar Zelle isoliert, Protein-Expression oder Aktivität-Modulation, Kultur und Downstream-Anwendungen eignen sich reichlich in der Ex Vivo Studie des acinar-duktale Metaplasie (ADM), einem frühen Ereignis in der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Erfahren Sie die Reprogrammierung von Pankreasduktalen Adenokarzinomzellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Lentivirus. Diese Methode ermöglicht die Etablierung stabiler iPSC-Linien zur Untersuchung der Krebsprogression.

Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz

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