Name: Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Lernen Sie die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Nanopartikelverteilung in Glioblastomen im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbildgebung therapeutischer Wirkstofflieferung.

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Wir danken dem Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, dem Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - Small Animal Imaging Center, dem NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) und der Stanford Preclinical Imaging Facility am Porter Drive für die Bereitstellung der Ausrüstung und Infrastruktur für dieses Projekt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des National Institute for Child Health and Human Development, Fördernummer R01HD103638, unterstützt. Wir bedanken uns bei der Schnitzer Group, Stanford University; das Zuo-Labor, Universität von Santa Cruz; und das Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, für pädagogische Diskussionen über Zwei-Photonen-Bildgebung und kraniale Fenstermodelle.

Echtzeit-Tracking von Nanopartikeln in Hirntumoren mittels 2P-IVM bei Mäusen

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
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<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
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<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
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<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Wir präsentieren eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-NP-Verfolgung mit 2P-IVM durch ein kraniales Fenster, um die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-NPs zu bewerten. Die Operationstechnik für diesen Eingriff erfordert eine ruhige Hand und fortgeschrittene experimentelle chirurgische Fähigkeiten. Es ist ratsam, den Umgang mit Kadavern oder Phantomen zu üben, bevor Sie zur Live-Tiererfahrung übergehen. Als Alternative implementierten Hoeferlin et al. einen Roboterbohrer, um thermische Schäden zu reduzieren, die Variabilität der Operationstechnik zu minimieren und die Chirurgie zu standardisieren22.
Die Größe des Fensters stellt einen weiteren kritischen Parameter dar. Ein größeres Fenster würde die Bildgebung eines größeren Teils des Tumors mit 2P-IVM ermöglichen. In der Literatur wurden Größen zwischen 3 und 7 mm beschrieben23. Größere Fenster können jedoch die Gehirnverkrümmung nicht aufnehmen, was zu einem erhöhten regionalen Druck führen kann24. Um diese Einschränkung zu überwinden, kann stattdessen ein sogenannter "Glasschädel" verwendet werden25. Im Vergleich zu herkömmlichen Glasfenstern wird bei dieser Methode gebogenes Glas verwendet, das die Krümmung des Gehirns ausgleicht und so die Schaffung größerer Fenster ermöglicht, während der Fokusdruck auf den Kortex reduziert wird. Diese Art von gebogenem Glas ist nicht im Handel erhältlich und hat nur begrenzte Anwendungen in 2P-IVM, da die gekrümmte Oberfläche Reflexionsartefakte verursacht, die den Bereich des Fensters begrenzen, der abgebildet werden kann. Eine weitere Alternative ist ein siliziumbasiertes Fenster24. Einerseits bietet diese Methode mehr Flexibilität in Bezug auf die Größe und Form des zu erstellenden Fensters. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf Fensterversagen und Entzündungsraten wie bei klassischen Glasfenstern berichtet. Andererseits hat sich gezeigt, dass die 2-Photonen-Abbildungsqualität in polymerbasierten Fenstern schneller abnimmt als in Glasfenstern, was sie für Langzeitanwendungen nicht praktikabel macht26. Ein ausgedünntes Schädelschädelfenster stellt eine weitere Alternative dar. Obwohl es weniger invasiv ist als das klassische Glasfenster, ermöglicht es keine GBM-Zellimplantation mit der gleichen Technik wie hier beschrieben. Darüber hinaus ist es schwierig, eine konsistente Schädeldicke zu erreichen, was zu erheblichen Artefakten in 2P-IVM27 führen kann.
Die Zelllinie und die Menge der implantierten GBM-Zellen sind weitere wichtige Überlegungen bei der Planung des Studienzeitplans. Die C6-Rattengliom-Zelllinie ist eine der am weitesten verbreiteten Zelllinien in der GBM-Forschung. Bei Ratten und Mäusen wurden Zellzahlen zwischen 5 x 104 und 5 x 106 für intrakranielle Implantationen berichtet 27,28,29,30,31. In der Regel ist bei der Implantation einer höheren Anzahl von Zellen mit einem schnelleren Tumorwachstum zu rechnen. In diesem Protokoll wurden 1 x 105 Zellen implantiert und die Bildgebung wurde an den Tagen 11 und 12 nach der Implantation durchgeführt. Xin et al. implantierten 1 x 105 C6-Zellen in BALB/c-Nacktmäusen und berichteten über den Nachweis eines fortgeschrittenen GBM im MRT am Tag 7 nach der Implantation und eine erhöhte Mortalität nach 15 Tagen30. Im Vergleich dazu verwendeten Jia et al. eine höhere Anzahl von Zellen (1 x 106) und den gleichen Mausstamm und detektierten am Tag 7 im MRT eine kleine Tumormasse mit einer leicht gestörten Blut-Hirn-Schranke (BHS), wie eine blasse Evans-Blau-Färbung im GBM-Gewebe zeigte32. An Tag 14 war die Evans-Blaufärbung stärker als an Tag 7, was darauf hindeutet, dass die BHS stark gestört war. Das Tumorwachstum wirkt sich wiederum auch darauf aus, wie lange die Tiere im Versuch gehalten werden können. Dies ist ein wichtiger Aspekt des Tierschutzes für Längsschnitt-Bildgebungsstudien. Es wurde berichtet, dass chronische Schädelfenster bis zu 6 Monate nach der Implantation für die Bildgebung geeignet sind26.
Die in diesem Protokoll verwendeten Nanopartikel bestehen aus Eisenoxid- und Fluorophorkomponenten. Mögliche Anwendungen sind die Untersuchung der Tumorabgabe neuartiger therapeutischer Medikamente, zellulärer Therapeutika und Eingriffe in das Tumorgefäßsystem und die Tumormikroumgebung. Verschiedene Wirkstoffkandidaten und Kombinationstherapien können auf zellulärer und molekularer Ebene evaluiert werden. Die Eisenoxidkomponente der NPs ermöglicht zusätzlich zu 2P-IVM eine multimodale Bildgebung mit MRT oder Magnetpartikelbildgebung. Während die MRT eine klinisch relevante Bildgebungsmodalität darstellt, ist ihre anatomische Auflösung der der Intravitalmikroskopieunterlegen 33.
Auch diese Methode hat gewisse Einschränkungen. Die Gehirnkoordinaten nach einem Mäusehirnatlas sind für C57BL/6J-Mäuse standardisiert und müssen je nach Mausstamm, Geschlecht und Alter angepasst werden. Darüber hinaus kann mit der Zwei-Photonen-Bildgebung nur eine begrenzte Tiefe von ca. 450 μm erreicht werden9. Daher ist mit 2P-IVM nur eine partielle Charakterisierung des Tumors möglich, und regionale Unterschiede in den Tumoreigenschaften konnten übersehen werden. Darüber hinaus wurden nur zwei Zeitpunkte nach der NP-Verabreichung berücksichtigt. Zukünftige Studien, einschließlich weiterer Zeitpunkte nach intravenöser Verabreichung, werden eine detailliertere Analyse des raumzeitlichen Verhaltens der NPs in der Tumormikroumgebung ermöglichen.
Abschließend untersuchten wir die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln mit 2P-IVM in einem Mausmodell von GBM. Diese Methode kann leicht an verschiedene Forschungsbereiche angepasst werden und stellt ein wichtiges Werkzeug für die In-vivo-Bildgebung des Gehirns im Bereich der Neurowissenschaften dar.

Die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) ist ein Fluoreszenzbildgebungsverfahren, das die Visualisierung von lebendem Gewebeermöglicht 1.
2P-IVM wurde erstmals in den 1990er Jahren entwickelt und wurde für die In-vivo-Analyse der Netzhaut2, der Niere3, des Dünndarms4, der Cochlea5, des Herzens6, der Luftröhre7 und des Gehirns in verschiedenen präklinischen Modellen verwendet 8,9. Im Bereich der Neurowissenschaften hat 2P-IVM als Technik für die Echtzeit-Bildgebung des gesunden Gehirns bei wachen Tierenan Bedeutung gewonnen 10 sowie zur Untersuchung von Erkrankungen des Nervensystems wie Alzheimer11, Parkinson12 und Glioblastom (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM bietet eine elegante Lösung für die Untersuchung der Tumormikroumgebung während der Entwicklung von GBM. Während sich einige frühere Studien auf In-vitro-17- und Ex-vivo-Modelle 18 konzentrierten, implementierten andere orthotopische19- und xenotrope20-In-vivo-Modelle zur Untersuchung von GBM. Madden et al. führten eine native Bildgebung der CNS-1-Rattengliomzelllinie in einem Mausmodelldurch 13. Unter Verwendung eines orthotopen GL261-DsRed-Mausmodells führten Ricard et al. eine intravenöse Verabreichung eines Fluorophors durch, um die Blutgefäße in der Tumorregion in 2P-IVM14 zu verbessern. 
Hier wenden wir 2P-IVM an, um die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln (NP) in einem orthotopen Mausmodell von GBM zu verfolgen. Mit Hilfe eines kranialen Fensters können wir mit dieser Methode die räumlich-zeitliche Verteilung von NPs im Gehirn in Echtzeit im Detail untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Infusionslösung</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritzen</td><td>BD</td><td>Luer-Lok Spritze, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Photonen-Mikroskop</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Applikatoren, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol, Sprühflasche</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap Antihaft-Aluminiumfolie</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesieüberwachung&nbsp;</td><td>Kent Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Nagetier-Pulsoxymeter</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x), flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Betadine-Applikatoren</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1,0 mg/mL</td><td>Stattdessen kann ein Generikum verwendet werden.</td></tr><tr><td>C6 Ratten-Gliom-Zelllinie</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Kanülen</td><td>BD</td><td>16 G, 1,1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer&nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Stattdessen kann ein Generikum verwendet werden.</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/Fläschchen</td><td>Es kann ein Generikum verwendet werden.</td></tr><tr><td>Zellsieb, 40 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen-Applikatoren, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Dental Cement Kit, klar, 2 Komponenten</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>Stattdessen kann ein Generikum verwendet werden.</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recovery, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Tuch&nbsp;</td><td>Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Bohrmaschine</td><td>Saeyang Microtech Escort</td><td>Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Bohrtipps&nbsp;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Size 005, US 1/4</td></tr><tr><td>FIJI Imaging Analysis Software</td><td>National Institute of Health</td> https://imagej.net/software/fiji/ <td></td> Pinzette Fisher Scientific 13-812-41 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Sterile Watte-Gaze-Pad, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelschaum&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp;</td><td>Surgifoam resorbierbarer Gelatineschwamm, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Keimer&nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp;</td><td>Germinator 500, Nr. 11688</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser, 5 mm Durchmesser</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Deckglas&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe, unsteril</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nitril puderfreie medizinische Untersuchungshandschuhe</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe, steril</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Church & Dwight</td><td>Nair Haarentferner-Lotion</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro; L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>Kopfstange</td><td>Hongway</td><td>5 mm Innendurchmesser O-Ringe</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Nagetierwärmer X2</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2 Zoll Festbrenne;</td><td></td></tr><tr><td>Eisenoxid-Nanopartikel</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme Ferumoxytol Injektion, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Stamm 005557</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Chirurgie)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartikel</td><td>Custom</td><td></td><td>Eisenoxid-Nanopartikel (Ferumoxytol), markiert mit Fluorescein-Isothiocyanat</td></tr><tr><td>Ophtalmische Salbe</td><td>Wichtige Pharmazeutika</td><td>Lubrifresh P.M. Nachtsalbe, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>Linde Gas & Ausrüstung Inc.&nbsp;</td><td>Hochdruckstahl Zylinder im K-Stil, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Plastikbecher</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Dixie Portionsbecher, 2 oz., Kunststoff, klar, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Einweg-Skalpell</td><td></td></tr><tr><td>aus Edelstahl Schere</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungsmittel</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Laborkittel</td><td>High Tech Conversions</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Vakuum Bottle Top Filtration Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Styroporbox</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Handschuhe</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgischer Kleber, 3M Vetbond Gewebekleber</td><td>3M Tierpflegeprodukte</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Schwanz Venenkatheter</td><td>Custom</td><td></td><td>Besteht aus zwei 30 G Kanülen, die mit Silikonschläuchen verbunden sind&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), ohne Phenolrot</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolett Taschenlampe</td><td>Frühlingssonne Technologie</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

zwei-photonen-intravitalmikroskopie des glioblastoms im mausmodell

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

Die Verabreichung von intravenös verabreichten Krebstherapeutika an Hirntumoren ist durch die Blut-Hirn-Schranke begrenzt. Eine Methode zur direkten Abbildung der Akkumulation und Verteilung von Makromolekülen in Hirntumoren in vivo würde unsere Fähigkeit, die Wirkstoffabgabe in präklinischen Modellen zu verstehen und zu optimieren, erheblich verbessern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-Verfolgung von intravenös verabreichten fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) in einem Mausmodell des Glioblastoms (GBM).
Das Protokoll enthält eine mehrstufige Beschreibung des Verfahrens, einschließlich Anästhesie und Analgesie von Versuchstieren, Schaffung eines Schädelfensters, GBM-Zellimplantation, Platzierung einer Kopfstange, Durchführung von 2P-IVM-Studien und postoperativer Versorgung für Langzeit-Follow-up-Studien. Wir zeigen repräsentative 2P-IVM-Bildgebungssitzungen und Bildanalysen, untersuchen die Vor- und Nachteile dieser Technologie und diskutieren mögliche Anwendungen.
Diese Methode kann leicht modifiziert und für verschiedene Forschungsfragen im Bereich der präklinischen Hirnbildgebung in vivo angepasst werden.

Hier führten wir eine kraniale Fensteroperation durch und transplantierten C6-Zellen in einem NSG-Mausmodell von GBM (n = 5). Eine ordnungsgemäße Abdichtung zwischen allen an der Herstellung des Fensters beteiligten Komponenten (Abbildung 1A) gewährleistet die Haltbarkeit der Fenster für die Langzeitbildgebung und reduziert zusätzlich die Morbidität. Mit dem für in vivo 2P-IVM angepassten Tisch (Abbildung 2) konnten wir Tiere unter Narkose bis zu 2 Stunden lang ohne größere Bewegungsartefakte abbilden. Etwa 10 Minuten nach intravenöser Applikation der Nanopartikel bei GBM-tragenden Mäusen zeigt 2P-IVM das grüne, fluoreszierende Signal von Gefäßen in der Region des Tumors, das mit der intravaskulären Lokalisation der FITC-markierten Nanopartikel übereinstimmt. Außerhalb der Blutgefäße wird nur eine geringe Menge an grün fluoreszierendem Signal festgestellt, was auf die beginnende Extravasation von NPs hinweist (Abbildung 3A). Es ist ein Anstieg des FITC-Signals aus dem extravaskulären Raum zu beobachten, was mit einer fortgeschrittenen Extravasation übereinstimmt (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Abbildung 1. Platzierung des Schädelfensters, Kraniotomie, Implantation und Bildgebung. (A) Querschnitt der anatomischen Platzierung eines Schädelfensters. Da der Kopfbügel metallfrei ist, ist es möglich, neben der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie auch eine Magnetresonanztomographie oder eine Magnetpartikelbildgebung durchzuführen. (B) Übersicht (obere Reihe) und Detailansicht (untere Reihe) der Kraniotomie (links), der Zellimplantation (Mitte) und der 2-Photonen-Intravitalmikroskopie (rechts). Beim Öffnen des Schädels kommt es zu oberflächlichen Blutungen (links) und wird schnell resorbiert (Mitte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Abbildung 2. Computergestützte Konstruktion (CAD) der Bühne. CAD des Tisches, der für die In-vivo-2-Photonen-Intravitalmikroskopie verwendet wird, einschließlich einer Beißstange, Kopfstangenstabilisierung und Schrauben für Höhen- und Winkeleinstellungen. Die 3D-CAD-Datei finden Sie in der ergänzenden Codierungsdatei 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Abbildung 3. In-vivo-2-Photonen-Intravitalmikroskopie-Aufnahmen. Bilder, die (A) 10 min und (B) 24 h nach intravenöser Verabreichung von Nanopartikeln aufgenommen wurden. Während die GBM-Zellen Fluoreszenzsignale im roten Spektrum (links) aussenden, sind die Nanopartikel im Hirngewebe grün (rechts) visualisiert. # zeigt extravasierte NPs an, * zeigt ein Blutgefäß an. Nur eine begrenzte Anzahl von Partikeln wurde extravasiert und ist 10 Minuten nach der NP-Verabreichung in der Nähe der Tumorzellen sichtbar. Im Bereich der GBM-Zellen ist eine Fülle von Partikeln sichtbar, was auf eine Extravasation 24 Stunden nach der NP-Verabreichung hindeutet. Die Nanopartikel bestehen aus Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Eisenoxid-Nanopartikeln (Ferumoxytol). Die Maßstabsbalken stehen für 100 μm. Abkürzungen: 2P-IVM: 2-Photonen-Intravitalmikroskopie, RFP: rot fluoreszierendes Protein, GBM: Glioblastom, FITC: Fluoresceinisothiocyanat, NP: Nanopartikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: 3D-CAD-Datei der Bühne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Das Glioblastom ist einer der häufigsten primären Hirntumore und wird mit schnellem Wachstum und geringer Lebenserwartung in Verbindung gebracht. Die Entwicklung wirksamer Therapien für Glioblastome bleibt eine große Herausforderung, da die Verabreichung von Therapeutika durch die Blut-Hirn-Schranke begrenzt ist. Eine Methode, um die Ansammlung und Verteilung von Makromolekülen im Gehirn direkt abzubilden, würde unsere Fähigkeit, die Verabreichung von Medikamenten zu verstehen und zu optimieren, erheblich verbessern.Die Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine elegante Lösung für die Untersuchung der Echtzeitverteilung von Nanopartikeln im präklinischen Modell des Glioblastoms. Durch die Modifikation des in dieser Studie verwendeten Nanopartikels ist es möglich, die Verabreichung verschiedener Wirkstoffkandidaten und Kombinationstherapien auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen. Neben der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie ermöglicht die Eisenoxidkomponente dieser Nanopartikel eine multimodale Bildgebung mit MRT oder MPI.Für die Zukunft könnten bildgebende Einrichtungen dazu dienen, die Früherkennung von Krebs zu realisieren und damit zu wirksameren Therapien gegen bösartige Neoplasien zu führen. Ein Weg, dies zu erreichen, ist die Verschmelzung der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie mit anderen Bildgebungsmodalitäten wie Positronen-Emissions-Tomographie und photoakustischem Ultraschall.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Intrakranielle Implantation von GL261-Zellen in C57BL / 6 Mäusen produziert maligne Gliome, dass viele Merkmale der menschlichen Glioblastoma multiforme zu rekapitulieren. Wir verwendeten GL261-Zellen stabil exprimiert Luziferase, damit wir...

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

In diesem Video führen wir eine intravitale Bildgebung von präinjizierten Krebszellen in einem Mausmodell über ein implantiertes Schädelfenster durch. Dieses hochauflösende Zeitraffer-Bildgebungsverfahren ermöglicht die Untersuchung des dynamischen Verhaltens von Krebszellen in der lebenden Maus.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: Eine bildgebende Technik zur Untersuchung des Verhaltens von vorinjizierten Krebszellen im Gehirn eines Mausmodells

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Molekulartomographie oder FMT für die in vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten in Mausmodellen. Die Technik ist nützlich, um die Wirkung von Anti-Tumor-Therapeutika auf molekularer Ebene aufzuklären.

Fluoreszenz-Molekulartomographie: Ein bildgebendes Verfahren für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten im Mausmodell

Quelle: Clark, A.J., et al. Biolumineszenz-Bildgebung eines immunkompetenten Tiermodells für Glioblastome. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfolgung des Fortschreitens des Glioblastoms in einem immunkompetenten Mausmodell, wobei Luciferase-exprimierende Tumorzellen und Luciferin zur nicht-invasiven Quantifizierung des Tumorwachstums verwendet werden.

Biolumineszenz-Bildgebung eines immunkompetenten Mausmodells für Glioblastom

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Lernen Sie die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Nanopartikelverteilung in Glioblastomen im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbildgebung therapeutischer Wirkstofflieferung.

Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie des Glioblastoms im Mausmodell

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