Name: Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Découvrez un test de gène rapporteur basé sur la luciférase pour étudier la biogenèse membranaire après phagocytose. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique impliquée dans la synthèse des lipides.

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Culture de cellules <ol><li> Cultures stock de rein embryonnaire humain 293 (HEK293) les cellules sont cultivées dans 10 cm de boîtes de culture en «milieu A &#39;, composé de milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) supplémenté avec un cocktail d&#39;antibiotiques (100 unités par ml de pénicilline et 100 pg par ml de sulfate de streptomycine) et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). </li><li> Pour mettre en place des cellules d&#39;une expérience, le milieu est aspiré et les cellules sont lavées deux fois avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Le PBS est ensuite retiré et remplacé par 0,6 ml d&#39;une solution contenant 0,25% de trypsine. </li><li> Le plat est incubé à 37 ˚ C pendant environ 2 min jusqu&#39;à ce que les cellules ont commencé à se détacher. </li><li> 5,5 ml de milieu A est ajouté pour neutraliser la trypsine et les cellules sont comptées avec un hémocytomètre. </li><li> Les cellules sont diluées à 320.000 cellules par ml et distribués à 0,1 ml par puits dans une polylysine enduits plaque de 96 puits de culture. </li><li> Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures. </li></ol> Transfections <ol><li> En se préparant pour les transfections, il devrait être considéré comme le nombre de répétitions sont à effectuer par les conditions expérimentales et quelles quantités de plasmide sera transfectées. Nous faisons régulièrement effectuer toutes les conditions en triple exemplaire et transfecter un total de 50 à 100 ng d&#39;ADN plasmidique par puits. Mélange plasmidique devrait comprendre au moins un journaliste construction exprimant la luciférase de luciole et un contrôle luciférase Renilla plasmidique exprimant à partir d&#39;un promoteur constitutif. </li><li> Solutions de plasmide sont pipetés dans des microtubes de 1,5 ml et complété avec 10 pi par échantillon de sérum et sans antibiotique DMEM. Par exemple, si 20 puits sont chacun à être transfectées avec 50 ug d&#39;ADN, ajouter 200 pl de DMEM à 1 ug d&#39;ADN. </li><li> Pour la solution de DMEM / ADN ajouter 3 ul &#39;Transit 293 réactifs »(Mirus) par ug d&#39;ADN. Mélanger à la pipette up &amp; down et laissez les échantillons reposer à température ambiante pendant au moins 10 min. </li><li> Durant cette période, retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de le remplacer par 90 ul de milieu frais A. </li><li> Pour chaque bien ajouter 10 ul de la DMEM / DNA / Transit 293 mélange. </li><li> Placer le plat dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ˚ C avec une atmosphère contenant du CO2 de 8,8% et de grandir pendant 24 heures. </li></ol> Phagocytose <ol><li> Préparer les suspensions contenant le milieu B (un mélange 1:1 de DMEM et Ham F12, plus des antibiotiques et 10% de FBS) majoré de 0,75 um de billes de latex à zéro à 1 mg par ml. </li><li> Retirez le support de la plaque de 96 puits de culture et de la remplacer par 0,1 ml de suspensions de billes dans le milieu B. </li><li> Faites tourner la plaque pendant 2 min à 1000 x g. </li><li> Les cellules sont ensuite cultivées à 37 ˚ C pendant 6 à 16 heures. Selon les conditions et le promoteur utilisé pour piloter la luciférase, une expression accrue du gène rapporteur peut être détectée après 1 à 3 heures. </li><li> Dans ce cas même il peut être nécessaire d&#39;incuber les cellules avec des billes de 30 à 60 min, puis faire deux lavages avec du PBS pour éliminer des billes non constituée en société, et d&#39;ajouter des milieux frais avant d&#39;incuber les cellules pour des périodes supplémentaires de temps. </li></ol> Double-GloTM Luciferase Assay <ol><li> Remarque: notre protocole pour l&#39;utilisation de ce kit diffère à certains égards de celle recommandée par le fabricant. Il a été modifié pour réduire la quantité de réactifs nécessaires par échantillon. </li><li> Préparer une solution de 1 M de DTT, la diviser en plusieurs petites portions et les conserver à -20 ˚ C. </li><li> Préparer un tampon de lyse contenant 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) de glycérol, et de 0,5% (v / v) de Triton X-100. Avant utilisation, une partie aliquote montant nécessaire pour l&#39;expérience et ajouter 1 l par ml de 1 M de DTT, plus un cocktail inhibiteur de la protéase à une concentration finale de 0,5 à 1x. Ne pas réutiliser les restes de la solution la TNT. </li><li> Lorsque vous utilisez le kit Dual-GloTM pour la première fois, de préparer le réactif (Firefly) luciférase en transférant l&#39;intégralité du contenu d&#39;une bouteille de tampon luciférase Dual-GloTM (fourni avec le kit) pour une bouteille de substrat luciférase Dual-GloTM (à condition avec le kit). Répartissez les réactifs non utilisés luciférase dans des aliquotes de 10 ml et conserver à -20 ˚ C. </li><li> Retirer la plaque de 96 puits de la incubateur de culture tissulaire et le placer sur la glace. Retirez le support par aspiration, ajouter 40 ul par puits de tampon de lyse, puis laisser la plaque sur la glace pendant 30 min. </li><li> Dans un blanc, opaque plaque de 96 puits (OptiplateTM-96, Perkin Elmer numéro de catalogue 6005290) aliquot 15 ul par puits de réactif luciférase, puis ajouter 15 ul de lysat cellulaire. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 min puis lisez la luminescence dans un lecteur de microplaques. </li><li> Immédiatement avant utilisation, préparer une quantité appropriée de solution de substrat Renilla luciférase en ajoutant 1 partie double GloTM Stop &amp; Glo ®; Réactif (fourni avec le kit) pour 100 parties Dual-Stop &amp; Glo GloTM ® Tampon (fourni avec le kit). </li><li> Pour chaque puits ajouter 15 ul par puits de la solution de substrat luciférase Renilla, incuber à température ambiante pendant 10 min, puis de mesurer la luminescence de nouveau. </li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

etudier biogenèse des membranes avec un luciferase assay-based gène rapporteur

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Pour étudier la coordination des différentes voies de synthèse des lipides au cours biogenèse membranaire, il est utile de travailler avec un système expérimental, où la biogenèse membranaire survient rapidement et de façon inductible. Nous avons trouvé que la phagocytose de billes de latex est pratique à ces fins que les cellules rapidement synthétiser les lipides des membranes pour reconstituer les piscines membrane perdue matériau d&#39;emballage au cours engloutissement de particules. Ici, nous décrivons les procédures pour l&#39;étude des changements dans la phagocytose induite par l&#39;expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur en utilisant le système Dual-Glo Luciferase Assay de Promega.

Ici, nous décrivons les procédures pour l&#39;étude des changements dans la phagocytose induite par l&#39;expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur utilisant le système à double GloTM Luciferase Assay de Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

Pour étudier la coordination des différentes voies de synthèse des lipides lors de la biogenèse membranaire, il est utile de travailler avec un système expérimental où la membrane...

Bonjour, je suis IL OV, et j'étudie la coordination des différentes voies de synthèse des lipides en lien avec la mémoire et la biogenèse. Il est utile de disposer d'un système expérimental dans lequel la biogenèse membranaire se produit rapidement et de manière inductible. Nous avons constaté que la phagocytose de billes de latex est particulièrement intéressante pour ces études, car les cellules synthétisent très rapidement de nouvelles membranes afin de remplacer celles qui ont été perdues comme matériau d'enrobage au début du processus d'englobement.Dans cette vidéo, mon collègue Ong Zang démontrera les procédures utilisées pour étudier les modifications de l'expression génique induites par la phagocytose, en employant une approche de test rapporteur basée sur la luciférase. Bonjour, je suis X du laboratoire d'exon North du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université Harvard. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment utiliser un test de gène rapporteur pour analyser la régulation des gènes impliqués dans la biogenèse membranaire après la phagocytose. Commençons donc.Pour cette procédure, nous utilisons des cultures de cellules rénales embryonnaires humaine

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Avec l'intérêt croissant pour les thérapies de cellules souches, des techniques d'imagerie moléculaire sont idéales pour le comportement des cellules souches de surveillance après la transplantation. Gènes rapporteurs luciférase ont permis non invasive, l'évaluation répétitive de la survie cellulaire, l'emplacement et la prolifération in vivo. Cette vidéo vous montrera comment suivre la prolifération des CSEh dans une souris vivante.

In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

La vidéo montre le dosage de la luciférase utilisé pour quantifier les protéines marquées à la luciférase. Le test utilise une enzyme luciférase modifiée composée d’un gros fragment qui se lie au petit fragment, qui est conjugué à une protéine d’intérêt. Les sous-unités liées forment une enzyme active qui, en présence du substrat, libère un signal luminescent. Ce signal est ensuite quantifié à l’aide d’un luminomètre.

Le test de la luciférase : un test à haut débit pour mesurer les signaux luminescents à l’aide de biorapporteurs basés sur le système de nanoluciférase

Cette vidéo montre le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour détecter les interactions protéine-protéine. Dans cet essai, les protéines d’intérêt sont associées à de petits et de grands fragments de l’enzyme luciférase. Lorsque les protéines interagissent, les grands et les petits fragments se combinent pour former un complexe enzymatique actif, qui, en présence d’un substrat spécifique, libère une luminescence brillante qui peut être mesurée.

Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.

Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Découvrez un test de gène rapporteur basé sur la luciférase pour étudier la biogenèse membranaire après phagocytose. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique impliquée dans la synthèse des lipides.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

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