Summary
Impression par microcontact est largement utilisé pour les protéines et autres molécules tendance sur les surfaces de matériaux. Nous démontrons les étapes de base de ce processus, l'estampage modèles de la fibronectine sur le verre.
Abstract
La capacité de protéines modèle et d'autres biomolécules sur des substrats est important pour saisir la complexité spatiale de l'environnement extracellulaire. Développement de l'impression par microcontact par le groupe Whitesides (
Protocol
1. Préparation des solutions et des matériaux
Ces étapes doivent être réalisées plusieurs jours à l'avance.
- Lamelles de verre. Lamelles ont été nettoyés par immersion pendant 10 minutes dans une solution de détergent Linbro 7X: l'eau, mélangée à un 1: 3 et chauffée, sous agitation, jusqu'à ce qu'il dégage. Lamelles ont été rincés abondamment à l'eau déminéralisée, puis cuite au four à 450 ° C pendant 6 heures. Chargement des lamelles en racks coloration céramique (voir réactifs) ont simplifié ce processus.
- Solution de protéines pour l'estampage. Fibronectine Reconstituer en suivant les instructions des fabricants d'une solution stock de 1 mg / ml de concentration.
2. Cast timbres du maître topologique
Ces étapes peuvent être réalisées plusieurs jours à l'avance. Timbres magasin pattern-up dans un plat couvert, comme une boîte de culture tissulaire.
- Enlever la poussière détacher de maître en utilisant un flux de comprimé, air filtré ou gaz inerte.
- Placez le maître, côté à motifs en place, dans le fond d'un plat en plastique juste plus grand que le maître. 60 - ou 100-mm boîtes de culture tissulaire sont bien adaptés à cet effet.
- Dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml, mélanger les composants Sylgard dans un rapport de l'agent de durcissement: la base d'élastomère de 1: 10 en poids. Mélanger soigneusement en utilisant un dispositif en plastique, comme une pipette jetable. Préparer au moins 0,2 ml d'élastomère par centimètre carré de surface plat.
- Centrifuger le tube de 50 ml à 300 g pendant 5 min pour éliminer les bulles d'air.
- Verser l'élastomère sur le maître, puis placer dans un dessiccateur sous vide, pendant 30 minutes.
- Cure de l'élastomère dans un four à 65 ° C pendant au moins 2 heures. Durcissement à température élevée et pour des résultats parfois plus en plus rigide élastomère. Laissez refroidir à température ambiante.
- Séparer la feuille de timbres du maître.
3. Impression par microcontact de la fibronectine sur le verre
- Découpez un timbre unique. Timbres mesurant 4 mm x 4 mm à 1 cm X 1 cm dans la zone et 1 - 2 mm d'épaisseur sont les plus faciles pour commencer. Côté tendance Placer sur une lame de verre ou un plat en plastique.
- Placez timbre dans un nettoyeur à plasma, et le processus, sous vide, pendant 30 secondes. Un Harrick scientifique Plasma cleaner (voir équipement), fixé à son cadre le plus élevé de sortie sera de rendre la surface hydrophile PDMS. Plus conséquent fois dans la fissuration de l'élastomère.
- Diluer la solution de fibronectine à l'eau déminéralisée à une concentration d'emboutissage de 50 pg / ml.
- Placer une petite goutte (10 - 50 pi) de l'estampage solution sur le timbre. Elle se propage à travers la surface hydrophile. Ajoutez seulement assez de solution que la chute couvre le timbre, mais ne fonctionne pas sur les bords. Laissez absorber des protéines pour éradiquer pendant 5 minutes.
- L'utilisation d'un Kimwipe ® ou d'autres tissus de papier propre, mèche pied la plupart de la solution de protéines à partir du timbre, sans toucher la région à motifs.
- Sécher la solution restante de la marque sous un courant d'eau propre, sec, gaz inerte, tel que l'azote.
- En utilisant une pince à épiler, retirez le tampon de la lame de verre, inverser, et mettre en contact avec la lamelle de verre nettoyée (la surface à motifs). Placez un poids dessus pour promouvoir un bon contact. Le poids spécifique qui fournit la meilleure structuration dépend de la taille d'un timbre et le modèle; commencer avec un poids de 5 g, et d'ajuster entre estampées. Laisser timbre en contact avec la surface pendant 1 minutes.
- Soigneusement démonter la pile, et le cachet distinct de lamelle.
- Vigoureusement rincer la lamelle à motifs en PBS, puis de l'eau déminéralisée, pour éliminer les protéines qui ne sont pas adsorbés à la surface. Lamelle à sec sous un courant d'azote.
Les résultats représentatifs
Impression par microcontact est un puissant processus de molécules sur les surfaces de motifs. Ce processus a la possibilité de créer des fonctions avec des dimensions allant de quelques dizaines de micromètres à quelques centaines de nanomètres; dans la Fig. 1A, les logos sur la gauche sont chacun 200 um de hauteur, tandis que les taches vertes illustré dans la figure. 1B sont une um de diamètre et espacés à intervalles de 4 um, mesurée de centre à centre. Fig. 1B illustre également une propriété de la puissante impression par microcontact, à savoir qu'il est et de processus additif. Plusieurs séries d'impression par microcontact peut être appliquée à une surface unique de créer des systèmes multicomposants 3.
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Discussion
Le processus d'impression par microcontact est conceptuellement simple et très robuste, ayant été appliqué à la structuration un large éventail de molécules sur une variété de substrats. Cependant, ce processus reste quelque chose d'un art. La géométrie spécifique de la structure à créer, protéine à motifs, le poids appliqué, et le revêtement / conditions d'emboutissage tous affecter la qualité d'emboutissage. Par exemple, trop peu de poids, appliquée à grands traits, aboutit souvent à des lacunes dans le modèle comme on peut le voir dans le logo en haut à droite de la Fig. 1A. A l'inverse, trop de poids va causer l'affaissement et l'effondrement du timbre, provoquant des retombées inattendues de protéines dans les régions entre motifs features.As un deuxième exemple, des protéines spécifiques (tels que les anticorps) modèle avec une meilleure fidélité si l'étape de traitement au plasma est omise, laissant le PDMS hydrophile. L'emboutissage de la fibronectine sur le verre qui est présenté ici comme un point de départ pour de telles modifications et optimisations, démontrant les techniques de base de ce processus.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
