현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
프로토콜
1. 정치
- 4 박 배아 ° C PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)와. 문제를 해결
- 삭제 수정하고 실온 (RT)에서 2 X PBS 5 분 각각 씻으십시오.
- 시계 제조인의 집게를 사용하여 유리 우울증 플레이트의 PBS에서 수동으로 dechorionate 배아. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 dechorionation 후, 배아는 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송됩니다.
- 오분 각 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 메탄올을 통해 배아를 전송합니다.
- 100 % 메탄올로 액체를 교체, 새로운 메탄올로 교체 후 5 분 부화합니다.
- 1 시간 최소 -20 ° C에서 장소 배아. (우리는 일반적으로 현장 하이브 리다이 제이션의 표준은 년 이상 보관 배아에서 작동합니다. 하룻밤 배아를 품어,하지만 우리는 현장 하이브리드화에 형광의 높은 해상도가 장기간 보관하여 분실 여부를 검사하지 않았습니다.)
- 75 % 오분 각각 50 %, RT에서 PBST에서 25 %의 메탄올을위한 배아를 씻으십시오. RT에서 오분 PBST에서 각각에 대해 두 번 씻으십시오.
- RT에서 PBS에 4퍼센트 PFA에 20 분 다....
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 일반적인 알칼라인 포스파타아제 매개 반응에서 30-45분간 염색 후 깨끗하고 강한 신호를 나타내는 프로브에 효과적입니다. 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization) 프로토콜을 수행하기 전, 당사는 항상 표준 비형광 프로토콜(프로브 합성 프로토콜과 함께 보충 자료로 제공됨)을 사용하여 프로브를 테스트합니다. 신호가 약한 프로브를 사용할 때는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜의 성공률이 낮았으나, 일부 경우에는 가능할 수도 있습니다. 당사는 형광 인시튜 하이브리다이제이션 프로토콜을 β-catenin 3의 면역국소화(immunolocalization)와 성공적으로 결합하였습니다. 이 변형법을 수행할 때는 낮은 온도에서 에피토프가 더 잘 보존되는 것으로 보이므로, HYB-, HYB+ 및 하이브리다이제이션 배양을 65°C 대신 55°C에서 진행합니다. 면역국소화 배양은 TSA 반응 후에 수행합니다.
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감사의 글
우리는이 프로토콜을 개발 Dörthe Jülich, 제니퍼 라운드와 앤드류 마라의 기여를 인정하고 싶습니다. NICHD, 미국의 암 사회와 천의 월에서 제공하는 연구 지원합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% 용액, EM 등급 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 1.33x PBS에서 4%로 희석(최종 1x). 2ml씩 분주하여 –20°C에 보관 |
| Proteinase K, recombinant PCR 등급 | Roche Group | 03115879001 | 증류수에 20mg/ml 스톡 용액을 제조. 1ml씩 분주하여 –20°C에 보관 |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | 1x maleic acid 완충액으로 10% 스톡 용액을 제조. 50ml씩 분주하여 –20°C에 보관. 여러 번의 동결-해동 과정 후에도 안정함. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | 분주하여 -20°C에 보관. 사용 중인 분주액 하나는 4°C에 보관. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | 위와 동일. |
| TSA Plus Fluorescein 시스템 | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | TSA 시약의 각 바이알은 필요할 때만 준비. 60μl DMSO에 용해. 4°C에 보관. |
| TSA Plus Cyanine5 시스템 | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | 위와 동일 |
| TSA Plus Cyanine3 시스템 | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | 위와 동일 |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | tyramide 시약을 150μl DMSO에 용해한 후 분주하여 –20°C에 보관. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | 500μg/ml 용액으로 공급됨 |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | 증류수에 1mg/ml 용액으로 공급됨. |
참고문헌
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T.
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