Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Summary

Wir zeigen die Verwendung eines konstanten Kraft Extensometer zur langfristigen Erweiterung (Kriechen) der pflanzlichen Zellwand Proben von sauren Puffern und expansin Protein induziert messen.

Abstract

Wachsende pflanzlichen Zellwände charakteristisch weisen eine Eigenschaft als "Säure Wachstum", mit denen wir meinen, sie sind mehr erweiterbare bei niedrigen pH-Wert (<5) ¹ bekannt. Das Pflanzenhormon Auxin schnell stimuliert Zellstreckung in jungen Stängel und ähnliche Gewebe zumindest teilweise durch eine Säure-Wachstums-Mechanismus ^{2, 3.} Auxin aktiviert eine H ^+-Pumpe in der Plasmamembran, Versauerung der Zellwand Lösung. Wand Versauerung aktiviert expansins, die endogene Zellwand-Lockerung Proteine ^​​4 sind, wodurch die Zellwand an der Wand Spannungen, die durch Zelle Turgor erstellt Ertrag. Als Folge beginnt die Zelle rasch vergrößern. Diese "acid Wachstum" Phänomen ist leicht in isolierten (unbelebten) Zellwand Proben gemessen. Die Fähigkeit der Zellwände zu Säure-induzierte Erweiterung unterzogen wird nicht einfach das Ergebnis der strukturellen Anordnung der Zellwand-Polysaccharide (zB Pektine), sondern hängt von der Aktivität der expansins ^5. Expansins haben noch keine bekannten enzymatischen Aktivität und der einzige Weg, um Assay für expansin Aktivität ist es, ihre Induktion von Zellwand-Erweiterung zu messen. Dieses Video Bericht beschreibt ausführlich die Quellen und die Vorbereitung Techniken zur Gewinnung von geeigneten Wandmaterialien für expansin Assays und fährt fort, Säure-induzierte Verlängerung und expansin-induzierte Verlängerung der Wand Proben aus wachsenden Gurke Hypokotylen vorbereitet zu zeigen.

Um geeignete Zellwand Proben, Gurkenkeimlingen im Dunkeln gezüchtet werden, die Hypokotyle geschnitten und bei -80 ° C eingefroren Gefrorene Hypokotylen abgetragen, abgeflacht, und dann bei konstanter Spannung in eine spezielle Küvette für Extensometer Messungen gespannt. Zur Messung säureinduzierte Erweiterung, die Wände sind zunächst im neutralen pH-gepuffert, so dass eine niedrige Aktivität der expansins, dass Komponenten des nativen Zellwände. Nach Puffer Austausch zu sauren pH-Wert, sind expansins aktiviert und die Zellwände zu verlängern schnell. Wir zeigen auch expansin Aktivität in einer Rekonstitution Assay. Für diesen Teil verwenden wir eine kurze Wärmebehandlung auf die native expansins in der Zellwand Proben zu denaturieren. Diese inaktivierten Zellwände nicht einmal verlängern in sauren Puffer, sondern zusätzlich von expansins die Zellwände schnell wieder ihre Fähigkeit, zu verlängern.

Protocol

Teil 1: Anbau und Lagerung geeignet Pflanzenmaterial

1. Nach unserer Erfahrung dienen junge Hypokotylen aus etiolierten Gurkenkeimlingen als eine bequeme Quelle für Zellwandmaterial für diese Experimente. Gurken Samen werden auf feuchtem Papier in einer lichtdichten Box, die in einem abgedunkelten Schrank in einem Raum mit konstanter Temperatur bei 26 gesetzt ist ° C zu halten gesät Die genaue Temperatur ist nicht entscheidend, wie alles, was zwischen 22 ° und 30 ° C sollte in Ordnung sein, aber die Temperatur bestimmen, wie schnell die Sämlinge eine angemessene Stufe der Entwicklung zu erreichen. Je wärmer die Temperatur, desto schneller werden die Sämlinge entwickeln. Wir verwenden in der Regel Sämlinge, wenn sie auf ca. 5 cm in der Länge, die 3-4 Tagen erreicht wird nach der Aussaat gewachsen. Es ist wichtig, dass die Sämlinge im Dunkeln gezüchtet werden, da schon geringe Mengen von Licht beeinflussen sowohl die Rate der Keimling Entwicklung und der Zellwand Eigenschaften, die wir mit dieser Technik zu messen. Am Tag 3 können Sie Einblick in die Box, mit einem dunklen grün gefilterte Licht, auf Sämling Entwicklung zu überprüfen.
2. Sämlinge sind schnell geschnitten und verpackt in kleinen Plastikdosen, 100-150 Sämlinge pro Feld und bei -80 ° C. Bei dieser Temperatur bleiben sie nützlich für Wochen.

Teil 2: Vorbereiten Zellwand Proben

1. Kleine Gruppen (8-10) von gefrorenen Schnitt Sämlinge aus dem Gefrierschrank, um eine isolierte Behälter mit einer -80 Gefrierschrank Block übertragen.
2. Die Kutikula für das Hypokotyl ist mit Carborundum abgerieben. Dies wird durch wiederholtes Ziehen der Hypokotyl zwischen Daumen und Zeigefinger, die mit einem dicken Brei aus nassen carborundum pulverbeschichtet sind fertig. Es dauert ein wenig Erfahrung, um die richtige Menge an Druck zu nutzen wissen: zu viel Druck und die Epidermis beginnt zu geschreddert und zerrissen, zu wenig Druck und die Nagelhaut wird nicht permeabilisiert werden. Man muss auch schnell arbeiten, weil die gefrorenen Hypokotyl taut, es schlaff und schwer zu verwalten wird.
3. Der Abrieb Hypokotyl ist in Eiswasser getaucht, um die meisten der anhaftenden Carborundum und dann auf Eiswasser gelagert zu entfernen, während die restlichen Hypokotylen in ähnlicher Weise zubereitet werden.
4. Die Hypocotyle sind auf die gewünschte Länge, in der Regel 1,2 cm schneiden, mit einem neuen einschneidig Rasierklinge und dann auf eine Glasplatte ausgerichtet.
5. Jetzt müssen wir die Wände zu reduzieren, um Zellsaft zu entfernen und zu erleichtern Spannen. Eine zweite Glasplatte befindet sich oben auf die Gruppe von 8-10 Proben platziert und bildet ein Sandwich. Ein Gewicht (400-500 g) befindet sich oben auf dem Objektträger für 5 min gestellt. Für das Gewicht verwenden wir routinemäßig ein Becherglas mit einer geeigneten Menge Wasser.
6. Optionaler Schritt: Je nach Experiment, die Hypokotyle kann mit einer kurzen Wärmebehandlung an dieser Stelle inaktiviert werden. Dazu binden wir die Glasplatten zusammen mit einem Paar von Gummibändern, legen Sie die Montage in einen Behälter mit 100 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur und legen Sie sie in der Mikrowelle bei voller Leistung. Mit unserer Mikrowelle das Wasser beginnt bei ca. 50 s kochen und wir stoppen die Mikrowelle 15 s nach dem Kochen beginnt. Das heiße Wasser wird schnell abgegossen und ersetzt mit kaltem Wasser, um eine Denaturierung zu stoppen. Eventuell müssen Sie diese Zeiten variieren, wie Ihre Mikrowelle kann anders als bei uns. Mit übermäßige Erwärmung der Proben werden schwach und brechen leicht. Bei ungenügender Beheizung des endogenen expansin nicht inaktiviert und der Wand Proben behalten einige Reaktionsfähigkeit auf sauren pH-Wert.

Teil 3: Extensometer Setup

1. Die Wand Proben werden nun in einer konstanten Kraft Extensometer geklemmt. Dies ist eine custom-built-Gerät, das aus einem Plexiglas Küvette besteht für die Abhaltung der basalen Ende der Wand Probe und eine bewegliche Klemme an der apikalen Ende der Probe. Die beweglichen Bügel am Ende einer Stange, die durch die offenen Spulen von einem Lagesensor Pässe montiert ist, ein LVDT oder "Linear Variable Differential Transformer", die elektronisch erfasst die Position eines kleinen Metallzylinder oder "Kern", das heißt an der Stange. Das obere Ende der Stange ist mit einem Hebel mit einem verstellbaren Gegengewicht verbunden. Dieser Hebel wirkt eine einstellbare Menge an aufwärts gerichtete Kraft auf die Wand Probe. Die Kraft wird durch das Hinzufügen oder Entfernen kalibrierten Gewichten aus Metall zum anderen Ende des Hebels eingestellt.
2. Zurück an der Wand Probe - der basalen Ende des Hypokotyl Probe wird mit feinen Pinzetten und ~ 2-3 mm von der apikalen Ende ist in zwischen den geöffneten Rachen des beweglichen Klammer gesetzt abgeholt. Diese Klemme ist eine federbelastete Krokodilklemme, deren Metall-Backen sind mit Kunststoff beschichtet, um einen direkten Kontakt zwischen der Metalloberfläche und der Pufferlösung oder an der Wand Probe zu verhindern. In unserer Erfahrung Metallionen können Lauge aus der Klemme und hemmen die Wand der Fähigkeit zu erweitern, und so halten wir das Metall bedeckt.
3. Halten Sie die beweglichen Klemmanordnung in einer Hand, ist die basale Ende der Wand Exemplar jetzt zwischen den beiden klappbaren Teile des Plexiglas Küvette und die Küvette manövriertStücke werden zusammen gebracht und fest verschraubt, damit Verriegelung am unteren Ende der Wand Probe in der Küvette.
4. Die bewegliche Klammer Montage ist nun sanft gelöst, so dass die volle Kraft der Gegengewichte an der Wand Probe übertragen werden. Wir verwenden routinemäßig insgesamt Gegengewicht von 20 g für die Wand-Proben aus Gurke Hypokotylen vorbereitet. Andere Wandmaterialien oder Experimente könnten erfordern unterschiedliche Gewichte.
5. Die Küvette wird mit Puffer gefüllt (200 UL) und die Position der Küvette nach oben oder unten mit einer Stellschraube, so dass die bewegliche Klemme am unteren Ende des LVDT Messbereich gebracht wird. Unsere LVDT ist es, eine Datenerfassungseinheit von einem Mikrocomputer verbunden ist, und so beobachten wir LVDT Position durch den Computer. Wir haben acht LVDT Baugruppen parallel mit einem Computer, die uns zu 8 Wand Proben gleichzeitig laufen zu lassen verbunden. Der Computer zeichnet die Position von jedem der LVDT Baugruppen einmal alle 30 s.

Teil 4: Mess-Erweiterung als Reaktion auf saure pH-Wert oder expansin - Repräsentative Ergebnisse

1. [First Experiment] Für die Messung des Säure-induzierten Verlängerung, beginnen wir mit einheimischen Wand Proben (dh nicht mit Hitze inaktiviert) und neutralen Puffer wird in die Küvette gegeben. Die Wand Proben zu verlängern für ein paar Minuten, in Reaktion auf die zusätzliche Spannung, aber die Erweiterung zerfällt zu einer niedrigen Rate nach ein paar Minuten. Unsere Computer lässt uns Monitor entweder die Veränderung der Länge der Probe (dh die Veränderung der Position des beweglichen Klammer, nach dem Start des Experiments), oder wir können die zeitliche Ableitung der Position zu überwachen, in anderen Worten: die Rate der Erweiterung . Die Erweiterung Rate stabilisiert auf einen niedrigen Wert mit der Zeit.
2. Nach ca. 20 min, ist die neutrale Puffer entfernt. Wir verwenden ein dünnes Metallrohr, aus einer großen Spurweite Injektionsnadel aus, verbunden mit einer Vakuumpumpe in den Puffer schnell zu entfernen, mit minimaler Störung der Wand oder der mechanischen Montage. Saure-Puffer zugegeben, manchmal mit 1-2 schnellen Austausch der kompletten Austausch zu sauren Puffer zu versichern. Dann haben wir lehnen Sie sich zurück und beobachten Sie die Reaktion der Wand. In der Regel können wir die Beschleunigung der Erweiterung in wenigen Minuten zu erkennen. Nach 60 min wir haben in der Regel genügend Informationen, um die Erweiterung Antwort zu bewerten, obwohl in einigen Fällen die Messungen auf längere Zeiträume erstrecken können.
3. [Zweiter Versuch] Zur Messung der expansin-induzierte Zellwand-Erweiterung, beginnen wir mit hitzeinaktiviertem Wand Proben und sauren Puffer in die Küvette gegeben. Wie bei dem ersten Versuch, die Rate der Zellwand Erweiterung allmählich stabilisiert auf einen niedrigen Wert, weil der Mangel an funktionellen expansin.
4. Nach ca. 20 min ist expansin Protein in die Küvette durch "Aufstocken" mit dem Puffer in die Küvette mit 10-20 uL einer expansin Lösung gegeben. Die expansin schnell dringt durch die Zellwand Probe und innerhalb weniger Minuten sehen wir, dass die Erweiterung gestiegen ist. Diese Erweiterung Antwort kann für eine Stunde oder mehr verfolgt werden.

Abbildung 1: Überblick über Verfahren zur Vorbereitung der Zellwände zu Säure-induzierte oder expansin-induzierte Wandfortsatz beurteilen.

Discussion

Für diese Demonstration verwendeten wir Zellwände von Gurken Hypokotylen, weil sie sich als eine zuverlässige Quelle für Wand-Proben, die leicht zu handhaben und mit guter Empfindlichkeit reagieren werden müssen. Wir haben auch schon gute Erfolge mit Wänden aus anderen Keimlingen sowie einige Materialien aus dem Supermarkt, wie junge Spinatblätter und Stangensellerie. Grundsätzlich sind jung, weich, schnell wachsende Pflanzengewebe wahrscheinlich leicht mit dieser Technik gemessen werden, sondern harte, alte, oxidierte oder nicht wachsenden Pflanzengewebe sind unwahrscheinlich zu sein, weil der Zellwand Vernetzung reagieren. Es gibt ein paar andere Dinge die man wissen sollte:

1. Biologische Variabilität - auch einheitliche Sämlinge geben variable Reaktionen, so dass ein Minimum von 5-8 Wiederholungen notwendig ist, um statistisch aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen.
2. Abrasion der Kutikula ist wichtig, um das schnelle Eindringen von Puffern und Proteinen in der Zellwand Probe zu ermöglichen. Wenn die Nagelhaut nicht ausreichend abgeschliffen werden Antworten auf sauren Puffern langsam und stumm und Proteine ​​können nicht einmal dringen in die Schuppenschicht, um eine Antwort zu entlocken. Einige Proben möglicherweise nicht brauchen Abrieb, dh wenn Sie epidermalen Schalen oder andere seziert Gewebe verwenden. Eine ungleichmäßige Abnutzung fügt signifikante Variabilität für viele Anfänger.
3. Hitzeinaktivierung, die zur Entfernung oder denaturieren endogenen expansins ist, kann durch andere Methoden durchgeführt werden, aber man muss die minimale Menge an Erhitzen auf endogene expansin inaktivieren, um übermäßige Schwächung und zum Bruch der Wand Proben zu vermeiden suchen.
4. Expansins sind anfällig gegenüber einer Inaktivierung durch Oxidation, so 1-5 mM Dithiothreitol in der Puffer in der Regel hilft bei der Tätigkeit zu stabilisieren.
5. Der Aufnehmer ist kein off-the-shelf Stück Ausrüstung, erfordert aber eigene Konstruktion von (a) die Küvette, dass die Wand Probe und (b) die LVDT-Clamp-Gegengewichtsanordnung hält. Der Computer-Schnittstelle und Datenerfassungseinheit sind nicht wesentlich, sondern sind besonders wertvoll für die Ausführung von Parallelproben gleichzeitig und für die Analyse der Dehnungskurven quantitativ.