Summary
photoswitching Intravital وتتبع Dendra2 المسمى الخلايا السرطانية من خلال نافذة الثديية التصوير هو الأسلوب الذي يسمح لنا صورة السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية في الورم microenvironments اختيار أكثر من مقياس من الأيام.
Abstract
في العقد الماضي ، الفحص المجهري intravital من أورام الثدي في الفئران والجرذان وحيدة الخلية في القرار
Protocol
1. جيل من الأورام الفلورسنت باستخدام حقن الخلايا السرطانية في الثدي وسادة من الدهون :
- تنمو الخلايا معربا عن خط Dendra2 البروتين (كعلامة هيولي) إلى 40 -- 80 ٪ confluency.
- شطف الأطباق على الأقل 3 مرات مع PBS ث / س كا 2 + 2 + أو Mg.
- أضف 3 مل من التربسين في صحن 10 سم واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى معظم الخلايا فصل ثم ضرب طبق على سطح مستو على التخلص منه.
- شطف كافة الخلايا خارج الصحن ، واستخدام مكشطة (شرطي المطاط) لجمع مصفوفة كذلك. أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني. يأخذ قسامة الاعتماد خلال الطرد المركزي.
- الطرد المركزي في 800 غ لمدة 5 دقائق.
- ونضح resuspend في برنامج تلفزيوني لتركيز 5 -- 10X 10 6 / مل. متجر على الجليد حتى يحقن (حقن في غضون 30 دقيقة).
- المكان قفص يحتوي على 4-5 الاسبوع الإناث المناعي القديمة الفئران ناقصة (على سبيل المثال SCID) داخل غطاء العقيمة.
- رش المنطقة المحيطة بالحلمة (البطن) 4 مع الايثانول 70 ٪.
- ضخ 0.1 مل إلى لوحة الدهون الثديية. إذا كان من الممكن العثور على مساعد ، يمكن للمرء أن الشخص الاستمرار على الماوس في المكان في حين يدرج الأخرى الإبرة داخل منصة الدهون الثديية. إذا كنت ترغب فى حقن بها نفسك ، ووضع تحت التخدير الماوس ضوء isoflurane به.
- بمجرد أن الورم قد نمت الى 5-7 ملم ، ينبغي إدراج نافذة التصوير الثديية (MIW).
ملاحظة : بدلا من ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات ، ويمكن إدراج MIW على قمة منصة صحية الدهون الثديية ، ويمكن حقن هذه الخلايا بعد ذلك. هذا النهج يسمح التصوير من الخلايا transfected عابر في البيئة الفسيولوجية.
2. دليل تلفيق نافذة التصوير الثديية (MIW) :
- مصنوعة MIWs (الشكل 1A) من البلاستيك النسيج الصف لضمان توافق مع الحياة. دليل للبناء ، ونحن نستخدم أطباق 5 سم أو 10.
- وضع قفازات اللاتكس على.
- تسخين طبق الأنسجة الثقافة ويخلق سطح منحن عن طريق دفع مدورة ، وجوه من الصعب على طبق ساخن (نستخدم قليلا dremmel 1 بوصة لهذا).
- قطع وسط الطبق باستخدام شفرة حلاقة ساخنة.
- استخدام صغيرة ، مخروطية الشكل لجعل بت dremmel حفرة في وسط القبة على شكل قاعدة من البلاستيك (6 - 7mm في القطر).
- جعل حواف قاعدة بلاستيكية سلس تماما الرملي فإنه مع dremmel ورفع مزيد عليه.
- ملف الجزء العلوي من قاعدة بلاستيكية جعل سطح مستو لساترة الزجاج. ينبغي أن قطرها من السطح ، قدم مسطح من 9 - 10MM.
- الغراء 8MM الزجاج الدائرية ساترة (رقم 1) على سطح بالارض باستخدام superglue (cyanoacrylate لاصقة).
- انتظر حتى يجف الغراء (15 دقيقة).
- استخدام إبرة ساخنة 26G لجعل ثقب الثقوب خياطة eight من الخارج (حيث الزجاج) إلى داخل القاعدة. وينبغي ثقوب موزعة بالتساوي في جميع أنحاء ساترة ، 0.5 - 1MM بعيدا عن حافة ساترة.
- توسيع الثقوب باستخدام إبرة خياطة 5-0.
- وثقب ثقوب في قاعدة بلاستيكية جعل السطح الداخلي متفاوتة. باستخدام الرمل ورقة ، وجعل هذا السطح على نحو سلس تماما.
- تغيير القفازات وفرشاة من جسيمات صغيرة من البلاستيك MIW باستخدام فرشاة صغيرة.
- يغسل بالماء MIW منزوع الأيونات.
- غسل MIW باستخدام الايثانول 70 ٪. استخدام Q - تلميح لتنظيف الزجاج بحيث يكون شفافا تماما. إذا كان هناك بقع ضبابية الحاضر من بخار الغراء ، وبعناية استخدام الأسيتون مع Q - تلميح.
- تعقيم MIW عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 3 ساعات في كل جانب.
شبه يدوي تلفيق نافذة التصوير الثديية (MIW) :
من أجل افتعال قاعدة من البلاستيك ، ونحن في الوقت الحاضر استخدام قوالب الصب المطاط سيليكون التي تم إنشاؤها باستخدام يدوية الصنع MIWs. ويتألف القالب من جزأين من المطاط سيليكون التي تجعل نسخة طبق الأصل من كل من الجبهة ومؤخرة الأصلي عند مليئة راتنجات البوليستر ثم التحق مباشرة معا. خلط السائل راتنجات البوليستر والنتائج معا 09:10 في بنية الثابت عند شفي تماما في 48h. البلاستيك والأشعة فوق البنفسجية المحمية والمحفوظات دون كسر أو يصبح أصفر مع مرور الوقت.
بعد الشفاء من القاعدة ، والخطوات تتم 2،8-2،16 بنفس الطريقة لMIWs يدويا الصنع.
3. ادراج MIW :
- وينبغي على المنطقة المحيطة بالحلمة ال 4 لديها الصغيرة (مم 5-7) الورم عدة أيام / أسابيع بعد حقن الخلايا السرطانية تبعا لنوع الخلية (الشكل 1B). مرت كم من الوقت بعد حقن الخلايا معربا عن Dendra2 البروتين أو البروتينات الفلورية photoswitchable الأخرى تعتمد على خط الخلية المستخدمة. وينبغي أن لا يكون الورم نخرية بوضوح ، وينبغي أن يكون الجلد السليم مع الشعر على أعلى من الورم. وينبغي أن يتم التخلص من أورام الفئران نخرية.
- إعداد الفضاء العقيمة لجراحة وضع قطعة من القماش المعقم داخل غطاء العقيمة. وضع قطعة معقمة زauze في الوسط ، ووضع MIWs قليلة والأدوات المعقمة من حوله : نستخدم معيار مقص صغير ، مقص الربيع ، ملاقط microdissecting ، microdissecting ملقط ، حامل الإبرة. إبقاء العقيمة Q - نصائح ، زجاجة من الايثانول 70 ٪ وقفازات معقمة في زاوية غطاء محرك السيارة.
- الفأر هو تخدير في غطاء محرك السيارة باستخدام الحقن المعقمة IP AVERTIN من 2.5 ٪ (20 ميكرولتر / غ) في HBSS ، أو بدلا من 10 ميكروغرام / كيلوغرام من الكيتامين + 10 ميكروغرام / ز زيلازين (الاتصال بك معهد رعاية الحيوان للحصول على الموافقات وترتيب).
ملاحظة : يجب أن يكون مستعدا آفيرتين حل مرتين في الأسبوع ، والتصفية تعقيمها باستخدام ميكرومتر 0.22 تصفية وتخزينها إلى 500 aliquots ميكرولتر في 4 درجات مئوية (في الظلام). - إزالة الشعر عن طريق حلق فوق منطقة الورم باستخدام ماكينة حلاقة الحيوانات الصغيرة.
- إزالة ما تبقى من الشعر باستخدام نير كريم إزالة الشعر (متوفرة في أي صيدلية). تنظيف الجلد باستخدام الايثانول انخفض Q - النصائح.
- نقل الحيوانات على وشاش معقم وتطبيق مرهم للعين للعيون لمنعهم من التجفيف والعدوى.
- تعقيم الجلد مع betadine ونظيفة مع الايثانول 70 ٪.
- نقل الحيوانات على القماش جراحية معقمة داخل غطاء العقيمة.
- سحب الجلد وسطي على الفور إلى الحلمة باستخدام ملقط وقطع شق 2mm و~ في الجلد.
- فصل الدهون الأساسية وسادة من جلد الثدي باستخدام مقص وملقط تشريح. الجلد وثقب تمتد خلال هذه الخطوة إلى حجم الفصل من شأنها أن تستوعب ادراج MIW.
- إذا ما ضربت بالصدفه سفينة خلال sugery ، واستخدام معقم Q - نصائح لإزالة أي الدم الذي يتم انتاجه / لوقف النزيف من أن تصبح مفرطة.
- إدراج MIW مثل الجلد أن هناك على رأس القاعدة MIW وخياطة في مكانها باستخدام الصفحات غير قابل للامتصاص وعكس قطع الإبرة.
- استخدام نسيج لاصق أو cyanoacrylate لملء الثقوب في خياطة وتأمين MIW على الجلد.
- TMP - SMX إضافة مزيج المضادات الحيوية : (سلفاميثوكسازول 0.6 ملغم / لتر ، تريميثوبريم 0.12 ملغ / مل) في قفص زجاجة ماء لمدة 3 أيام قبل وبعد الجراحة.
- الحيوان يبقى تحت التخدير ل4H - 1 IP AVERTIN بعد الحقن. منذ الجراحة تستغرق عادة ~ 45min ، فمن المهم لمساعدة الحيوانات على التعافي بعد ذلك :
- وضع وسادة التدفئة اليد (37 درجة مئوية) (متوفرة في الصيدليات) على الجزء السفلي من القفص وتغطيتها بشاش.
- الحفاظ على الحيوانات في أعلى لوحة حتى يتحول على بطنه ويبدأ المشي.
- إذا كان هذا الحيوان هو فاقد الوعي لأكثر من 3H ، ضخ 0.3 مل من intraperitoneally HBSS لمعالجة الجفاف.
- ولا يسمح للحيوان لاسترداد خلال الأيام القادمة 3-4 قبل دورة التصوير الأول تأخذ مكان.
4. التصوير صندوق البناء
مربع التصوير يؤكد أن MIW يجلس شقة ، والحق فوق الهدف المجهر. كما يسهل التحكم في درجة الحرارة وتدفق الهواء من خلال التخدير المستمر isoflurane. وقدم مربع من زجاج شبكي ولصقها معا باستخدام لحام البلاستيك. وهو مجهز للمرحلة المجهر محددة ، وبالتالي شكل القاع تختلف تبعا للمجهر المستخدمة (ويبين الشكل 2 مخطط مربع مجهزة لمرحلة مجهر لايكا SP5).
أبعاد بالسنتيمتر المربع هي ل = 11.4 سم ، ث = 7.6 سم ، ح = 4.4 سم (الشكل 2A). الجزء السفلي من مربع يتكون من لوحة جوفاء ، 12.7x8.4 سم في الحجم ، والتي تناسبها داخل مجهر لايكا المرحلة SP5 ، واثنين من الانزلاق "الأبواب" ، و 5.7 X 5.7 cm_each ، التي تشكل فتح التعميم (د = 2.22 سم ) عندما مغلقة. وMIW يلائم هذا الافتتاح. القطعة الأمامية يحتوي على فتحة المدخل لإيصال التخدير بينما واحد من القطع الجانب يحتوي على فتحة المخرج الذي يؤدي إلى فراغ.
لاحظ أن المكثف وحامل الشرائح التي يجب إزالتها قبل التصوير موضع مربع.
5. التصوير استخدم مربع
- وضع الحيوان تحت التخدير مع isoflurane وتطبيق مرهم للعين للعيون.
- إرفاق العادم isoflurane من آلة التصوير إلى تخدير أمام مربع ، في الجزء الخارجي من ثقب مدخل (الشكل 2B).
- نعلق أنبوب الثانية للمخرج ثقب مربع التصوير. يجب أن يرفق هذا الأنبوب لتصفية الغاز وبعد ذلك إلى فراغ.
- فتح غطاء الصندوق وفتح الأبواب مربع ومكان الحيوان ، والتي تواجه MIW الجانب السفلي ، وانزلاق الأبواب داخل منطقة الجزاء.
- عقد الصندوق وضبط الأبواب أسفل بحيث يتم عقد قاعدة MIW ويجمد بينهما. يجب أن تكون على قاعدة MIW نفس مستوى الأبواب مربع التصوير ، في حين أن ساترة MIW ينبغي أن يكون مجرد بضعة ملليمترات أسفل هذا المستوى. تأكد من أن المواقع من MIW بين أسفل الأبواب المنزلقة يضمن ساترة (جزء من الزجاج MIW) تقع شقة ، وموازية لأسفل الأبواب مربع. وسوف يركز هذا ضمان المناسبة.
- انخفاض الهدف المجهر ، لتفسح المجال للوضع في خانةقمة المرحلة المجهر.
- مكان مربع على المسرح المجهر ، وضبط مرحلة بحيث ساترة MIW فوق الهدف.
- التركيز على الهدف والبدء في التصوير.
- أثناء استخدام isoflurane ينبغي رصد هذا الحيوان عن طريق التفتيش البصري وتيرة التنفس. يمكن القيام بذلك بشكل مرئي ، أو من خلال مراقبة وتيرة الأعمال الفنية التي تظهر في التنفس أثناء جمع التصوير (وهذه يمكن أن تتداخل مع الحصول على البيانات). وقد استخدم oximetry نبض MouseOx النظام (ستار الحياة العلوم كورب) بنجاح. يمكن أن تكون طريقة جمع البيانات بشكل مستمر دون تحول الأضواء في الغرفة للاطمئنان على الحيوان.
ملاحظة : بعد كل جلسة التصوير ، وينبغي تسهيل الانتعاش الحيوانية التفاف للتدفئة وسادة صغيرة في اليد أو شاش kimwipes ووضعه تحت الحيوان في القفص.
ملاحظة : إذا تم استخدام الغمر لصورة موضوعية عن طريق MIW ، يجب تنظيف وسيلة الغمر (الجلسرين والماء والنفط) خارج إطار التصوير. وينبغي أن تفقد MIW عن أي شروخ أو غيرها من الأضرار التي قد حدثت أثناء التصوير. هذا أمر بالغ الأهمية لجمع البيانات خلال جلسات التصوير متعددة.
6. Photoswitching والتصوير من الخلايا التي تحمل علامات Dendra2
يوصف الداخلي للمجهر لايكا مبائر SP5 ، وقوة الليزر في المستوى البؤري ، والأهداف والخيارات المتاحة عند استخدام البرمجيات تختلف المجاهر مبائر أخرى أو multiphoton التصوير اقامة ، وبالتالي فإن بروتوكول المذكورة أدناه ينبغي أن تستخدم كدليل لتحسين التجربة على مجهر الخاص.
- من خلال مراقبة الورم من خلال العدسة (10X) مع تصفية مضان أخضر ، موقع الأوعية الدموية الرئيسية التي تتدفق بشكل واضح ، ووضع شقته في الطائرة الاتصال نفسه.
- واحدة من السفن في وسط الميدان ، والتحول إلى الكشف PMT الموقف.
- إعداد متسلسلة جمع التصوير للقناتين. واحدة من قنوات 488nm الليزر يستخدم الخط (10 ٪ طاقة) ، ويجمع تناثر من المصفوفة خارج الخلية (480 - 495nm) والانبعاثات من النموذج الخضراء Dendra2 (505 - 540nm). القناة الثانية يستخدم الليزر 543nm خط (90 ٪ طاقة) وتجمع الانبعاثات من النموذج الأحمر Dendra2 (555 ل 600Nm). جمع الصور 3D قبل photoswitching.
- استخدام الخيار لمسح ROI photoswitch سكان مختارة من الخلايا باستخدام خط الليزر 405nm (30 ٪ من الطاقة ، ومسح 20-40). جمع الانبعاثات من النموذج الاحمر من البروتين لرصد التحول.
- باستخدام نفس الروتين متتابعة كما في 6.3 ، وجمع آخر تبديل الصور 3D.
- إذا photoswitching أكثر من منطقة واحدة في الورم ، وينصح لالتقاط الصور من خلال oculars باستخدام الكاميرا الرقمية ، سواء في قنوات الأخضر والأحمر (الشكل 3A ، B). وهذا سوف يساعد في التوجه خلال جلسات التصوير لاحقة.
ملاحظة : بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون الأوعية الدموية المسمى مؤقتا باستخدام الذيل حقن الوريد ديكستران فلوري (أزرق أو تتالي اليكسا فلور 647 ، وكلاهما 10kDa). وبعد ساعات قليلة بعد الحقن ، وسوف يغادر dextrans الأوعية الدموية والتسمية بشكل دائم الضامة.
ممثل النتائج :
الرقم 3C يظهر مستطيل photoswitched المنطقة (الحمراء) الموجهة orthogonally نسبة إلى الأوعية الدموية (لا مضان). غير photoswitched الخلايا الخضراء ، في حين تناثر من المصفوفة خارج الخلية هو الأرجواني. الصورة هي الإسقاط كثافة أقصاها أربع صور على طول محور Z - (20-50 ميكرون العمق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع الأميركية (BG BC075554 لوBC061403 إلى DK) الأميركية ، والمعاهد الوطنية للصحة (U54GM064346 لJvR ؛ CA100324 إلى JC ، JES وJW ؛ CA77522 لJES ، U54CA126511 إلى JC وBG). نشكر دال Entenberg للحصول على مساعدة المجهري ، M. Rottenkolber للمساعدة في تصنيع مربع التصوير وياء بولارد (كلية ألبرت آينشتاين للطب) للأجسام المضادة F4/80.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
