Summary
Dendra2标记通过乳腺成像窗口肿瘤细胞的活体photoswitching和跟踪是一种技术，它使我们的图像多天的时间刻度选择了肿瘤微环境中的肿瘤细胞的转移行为。
Abstract
在过去的十年，活体显微镜的分辨率在单细胞在小鼠和大鼠乳腺肿瘤
Protocol
1。荧光肿瘤生成肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫：
- 长出的细胞系表达Dendra2蛋白（细胞质标记）40 - 80％汇合。
- 冲洗菜至少3次，用PBS W / O 型的Ca 2 +或Mg 2 + 。
- 添加每10厘米的菜，并培育3毫升的胰蛋白酶在37℃直至大部分细胞分离，然后撞到一个平面上动摇它的菜。
- 冲洗关闭菜中的所有细胞，并用刮板（橡胶警察），以及收集矩阵。新增的5毫升的PBS。取一个分装在离心计数。
- 离心5分钟，在800克。
- 吸用PBS重悬，以浓度为5 - 10倍10 6 /毫升。冰商店，直到注射（30 min内注入）。
- 无菌罩内含有4-5周龄女性免疫（如免疫缺陷）缺陷小鼠放在一个笼子里。
- 第四届（腹部）用70％乙醇的乳头周围喷洒的面积。
- 乳腺脂肪垫注入0.1毫升。如果可以找到一个助手，一个人就可以举行到位的鼠标，而其他针插入乳腺脂肪垫内。如果你自己注射用异氟醚，浅麻醉下鼠标。
- 一旦肿瘤已经发展到5-7毫米，乳腺影像窗口（MIW）应插入。
注：另外，对于某些应用，可以插入MIW健康的乳腺脂肪垫的顶部和细胞随后被注入。这种方法允许在生理环境中瞬时转染的细胞成像。
2。手工制作的乳腺影像窗口（MIW）：
- 组织级塑料MIWs（图1A），以保证生物相容性。对于手动建设中，我们使用5年或10厘米的菜。
- 把乳胶手套。
- 热了起来，推着一个圆形硬物，对加热盘（我们使用一个1英寸的dremmel位）一个组织培养皿中，共创一个曲面。
- 切出的菜使用了激烈的刀片中心。
- 使用一个小，圆锥状dremmel位，使中心的圆顶形的塑料底座（直径6 - 7MM）一个洞。
- 塑料底座的边缘打磨dremmel进一步提交的顺利。
- 文件一个平坦的表面玻璃盖玻片的塑料基地顶部。应提交的，平坦的表面直径9 - 10mm的。
- 胶8毫米的圆形玻璃盖玻片上平展的表面使用的强力胶（1号）（氰基丙烯酸酯胶粘剂）。
- 等待胶水干（15分钟）。
- 使用了激烈的26G针八个缝合穿刺孔从外部（玻璃）基地内。孔应均匀分布各地的盖玻片，盖玻片边缘0.5 - 1mm的距离。
- 拓宽使用5-0缝合针的孔。
- 在塑料基穿刺孔的内表面凹凸不平。用沙纸，使这个表面完全平滑的。
- 更改小塑料颗粒，用小刷子MIW的手套和刷子。
- 用去离子水清洗MIW。
- 使用70％乙醇洗净MIW。使用棉条的清洁，所以它是完全透明的玻璃。如果有云里雾里的点，从目前的胶水蒸汽，小心使用棉条丙酮。
- 在每边为3 h的紫外线照射消毒MIW。
半手工制作的乳腺影像窗口（MIW）：
为了制造塑料的基础，我们目前使用的硅橡胶铸模创建使用手工制作的MIWs。模具是由两个部分硅橡胶，使双方的正面和背面的原始充满聚酯树脂，然后立即联手的精确副本。液体聚酯树脂混合在一起，在硬盘的结构完全治愈在48小时时9:10和结果。塑料是没有打破或随着时间的推移成为黄色的紫外线保护和档案。
基地治愈后，步骤2.8-2.16都做同样的方式为手动MIWs。
3。插入的MIW：
- 4 个乳头周围的区域应该有一个小的（5-7毫米直径）肿瘤取决于细胞类型（图1B）的肿瘤细胞注射后的数天/周。已经过去了多少时间，Dendra2 photoswitchable蛋白或其他荧光蛋白表达的细胞注射后取决于所使用的细胞线。肿瘤不应明显坏死，应该有一个完整的皮肤肿瘤上方的头发。肿瘤坏死的小鼠应安乐死。
- 准备手术的无菌空间，放下一块无菌罩内的无菌布。把一块无菌克auze在中间，并奠定了几MIWs和它周围的无菌文书：我们使用标准的小剪刀，弹簧剪刀，microdissecting镊子，microdissecting钳，持针器。保持无菌的Q -提示，一瓶70％的乙醇和罩在角落的无菌手套。
- 鼠标是在无菌罩麻醉使用的HBSS 2.5％avertin IP注射液（20μL/ G），或另外10微克/公斤氯胺酮+ 10微克/克甲苯噻嗪（审批和订购，联系你的动物保健研究所）。
注：应准备Avertin解决方案双周，过滤消毒使用0.22微米的过滤器和储存500μL分装在4 ° C（在黑暗中）。 - 取出头发剃上述使用一个小动物剃须刀的肿瘤面积。
- 删除其余的头发使用奈尔脱毛膏（可在任何药店）。清洁皮肤使用乙醇浸的Q -提示。
- 动物转移到无菌纱布和眼药膏眼睛，以保持干燥和感染。
- 用优碘消毒皮肤，并用70％乙醇清洗。
- 转移到无菌罩内的无菌手术布的动物。
- 拉扯皮肤，立即使用产钳和切割〜2mm的切口，在皮肤乳头内侧。
- 分开使用夹层的剪刀和镊子皮肤底层的乳腺脂肪垫。皮肤在这种分离的步骤大小，将容纳插入MIW洞里。
- 如果意外的船只是在sugery打，使用无菌的Q -技巧，以消除任何生产/停止出血，成为过度的血液。
- 有皮肤到位MIW基地和缝合上使用非吸收线和反向切割针插入MIW。
- 使用组织粘合剂或氰基丙烯酸酯，以填补在缝合孔和保护皮肤的MIW。
- TMP - SMX抗生素混合添加：（磺胺甲基异恶唑0.6毫克/毫升，甲氧0.12毫克/毫升）入笼前和手术后3天一瓶水。
- 在麻醉状态下的动物保持avertin腹腔注射后1 - 4H。由于手术通常需要〜45分钟，重要的是要帮助动物恢复之后：
- 将手加热垫（37 ° C）在笼子的底部（在药店），并用纱布覆盖。
- 保持垫之上的动物，它的肚子上，直到它关闭，并开始步行。
- 如果动物是无意识3h以上，注入0.3毫升的HBSS腹腔补液。
- 动物是可以恢复在未来3-4天前发生的第一次成像会议。
4。成像盒建设
保证MIW是坐在平面以上的显微镜物镜，成像盒。它也有利于通过控制温度和麻醉异氟醚的恒定气流。这个盒子是由有机玻璃粘在一起使用塑料焊接。它配备的具体显微镜阶段，因此其底部的形状各不相同，取决于使用（图2显示了徕卡SP5显微镜载物台装有框的计划）显微镜。
一盒以厘米为单位的尺寸为L = 11.4厘米，宽7.6厘米，H = 4.4厘米（图2A）。盒子的底部由空心板，12.7x8.4厘米大小，里面适合徕卡SP5显微镜载物台，和两个滑动“门”，5.7 × 5.7 cm_each，从而形成一个圆形开口（D = 2.22厘米）时关闭。 MIW适合这样的开场白。前片含麻醉分娩的入口孔，而侧块包含一个电源插座孔，导致真空。
需要注意的是冷凝器和幻灯片持有人需要拆除成像盒放置前。
5。成像盒使用
- 与异氟醚麻醉下放置动物的眼睛和应用眼药膏。
- 将异氟醚麻醉机废气成像盒正面，对外面的进水孔（图2B）。
- 将第二个管成像盒的插座孔。此管应连接到气体过滤器，然后在真空。
- 打开盒盖，打开箱门和地方的动物，MIW面朝底部，和成箱的滑动车门。
- 按住方块和调整的底部，使MIW基地举行它们之间的固定门。 MIW基地应在同一级别的成像盒门，而MIW盖玻片应低于这个水平只是一个几毫米。请确保MIW之间的推拉门底部的定位，确保盖玻片（玻璃部分MIW）平躺，平行于底部的门框。这将确保正确聚焦。
- 降低显微镜物镜，允许框的位置空间在显微镜阶段的顶部。
- 放在显微镜舞台上的方块，调整的阶段，因此，MIW盖玻片上述目标。
- 聚焦的目标和启动成像。
- 虽然使用异氟醚，动物应监测呼吸频率的目视检查。这可以在视觉上，或通过监测呼吸文物成像集合（这些干扰与数据采集）期间出现的频率。 MouseOx脉搏血氧仪系统（斯塔尔生命科学公司）已成功使用。这样的数据可以收集不断无需打开房间的灯检查动物。
注：每个成像会后应便利包装的小手，在加热垫纱布或kimwipes置于它在笼子里的动物，动物恢复。
注意：如果浸泡的目的是通过MIW形象，应该清除浸泡介质（甘油，水，油）的成像窗口。 MIW应检查成像过程中可能发生的任何裂纹或其它损坏。这是多种成像会议期间收集的数据的关键。
6。 Photoswitching和Dendra2标记细胞成像
程序是徕卡SP5的共聚焦显微镜;不同焦平面的激光功率，可用的目标和软件选项使用其他共聚焦显微镜，多光子成像成立，因此，下文所述的协议应为指导用于优化您的显微镜实验。
- 通过观察肿瘤与绿色荧光过滤器的目镜（10倍），找到主要血管，这是明显的流动和铺设在同一焦平面单位。
- 位置的领域，并切换到光电倍增管检测中心的船只之一。
- 设置两个通道的顺序成像收集。的渠道之一，使用488nm激光线（10％的电力），并从细胞外基质（480 - 495nm）和绿表Dendra2（505 - 540nm处）的排放收集的散射。第二条通道，使用543nm激光线（90％的电力）和收集Dendra2红色形式（555 - 600nm处）的排放量。收集预photoswitching的三维图像。
- 使用的投资回报率的扫描选项，光控选择一个使用405纳米的激光线（30％的电力，20-40扫描）的细胞人口。收集排放的蛋白质的红色形式监测开关。
- 使用相同的顺序6.3常规，收集后切换3D图像。
- 如果photoswitching一个以上的地区，在肿瘤，应采取在绿色和红色通道（图3A，B），通过使用数码相机的目镜的照片。这将有助于方向，在随后的成像会。
注：此外，血管可以暂时采用尾静脉注射荧光葡聚糖（级联蓝色或的Alexa Fluor 647，既10kDa）标记。右旋糖酐注射后几个小时，将离开血管和永久标签的巨噬细胞。
代表性的成果：
图3C显示了一个长方形photoswitched的区域（红色）面向正交相的血管（无荧光）。非photoswitched细胞是绿色的，而从细胞外基质的散射是紫色的。 Image是一个四象沿Z轴（20-50微米深度）的最大强度投影。
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Acknowledgments
这项工作是支持由美国国防部（BC075554 BG和BC061403到DK），美国国立卫生研究院（U54GM064346到杰威尔; CA100324赛马，JES和JW; CA77522的JES，U54CA126511 JC和BG）。我们感谢Entenberg D.显微镜，M.成像盒和J.波拉德（阿尔伯特爱因斯坦医学院）F4/80抗体制造的帮助Rottenkolber帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
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