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Biology

Dendra2 photocommutation travers la fenêtre d'imagerie mammaire

Published: June 5, 2009 doi: 10.3791/1278
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 2Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 3Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht

Summary

Photocommutation intravitale et de suivi des Dendra2 marqué les cellules tumorales à travers la fenêtre d'imagerie mammaire est une technique qui permet d'imager le comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements tumoraux choisis sur une échelle de temps de jour.

Abstract

Dans la dernière décennie, la microscopie intravitale des tumeurs mammaires chez la souris et le rat à une seule cellule de résolution

Protocol

1. Génération des tumeurs fluorescentes à l'aide d'injection de cellules tumorales mammaires dans le pavé gras:

  1. Cultivez une lignée cellulaire exprimant Dendra2 protéines (comme un marqueur cytoplasmique) à 40 - 80% de confluence.
  2. Rincer la vaisselle au moins 3 fois avec du PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +.
  3. Ajouter 3 ml de trypsine par 10 cm de plat et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que la plupart des cellules se détachent et ensuite frappé du plat contre une surface plane pour le secouer.
  4. Rincer toutes les cellules hors du plat, et d'utiliser un grattoir (spatule en caoutchouc) pour collecter la matrice ainsi. Ajouter les 5 ml de PBS. Prélever une partie aliquote de compter pendant la centrifugation.
  5. Centrifuger à 800 g pendant 5 min.
  6. Aspirer et remettre en suspension dans du PBS à une concentration de 5 - 10x 10 6 / ml. Magasin de la glace jusqu'à injecté (injecter dans les 30 min).
  7. Placez une cage contenant 4-5 semaines vieilles immunitaire féminin souris déficientes (par exemple SCID) à l'intérieur d'une hotte stérile.
  8. Pulvériser la zone autour de la 4ème (abdominaux) mamelon avec 70% d'éthanol.
  9. Injecter 0,1 ml dans coussinet adipeux mammaire. Si un assistant peut être trouvé, une personne peut tenir la souris en place tandis que les autres insertions de l'aiguille à l'intérieur du pad mammaires graisse. Si vous vous injectez vous-même, mettre la souris sous anesthésie légère en utilisant l'isoflurane.
  10. Une fois la tumeur s'est développée pour 5-7 mm, la fenêtre d'imagerie mammaire (MIW) doit être inséré.
    Remarque: Vous pouvez également, pour certaines applications, la MIW peuvent être insérés sur le dessus du pavé saine graisse mammaire et les cellules peuvent être injectées par la suite. Cette approche permet l'imagerie de cellules transfectées de façon transitoire dans un environnement physiologique.

2. La fabrication manuelle de la fenêtre d'imagerie mammaire (MIW):

  1. MIWs (figure 1A) sont faits de plastique de qualité des tissus afin de garantir la biocompatibilité. Pour la construction manuelle, on utilise 5 ou 10 cm plats.
  2. Mettez des gants en latex sur.
  3. Faire chauffer un plat de culture de tissus et creat une surface incurvée en appuyant sur un arrondi, un objet dur contre le plat chaud (nous utilisons un peu de 1 pouce dremmel pour cela).
  4. Découpez le centre du plat en utilisant une lame de rasoir chauffé.
  5. Utilisez un petit peu en forme de cône dremmel de faire un trou dans le centre de la coupole en forme de base en plastique (6-7mm de diamètre).
  6. Faire les bords de la base en plastique complètement lisse en la ponçant avec du dremmel et encore son dépôt.
  7. Fichier en haut de la base en plastique faisant une surface plane pour la lamelle de verre. Le diamètre de l'déposée, surface plane doit être 9-10mm.
  8. Collez les circulaires en verre 8mm lamelle (numéro 1) sur la surface aplanie à l'aide de la superglue (colle cyanoacrylate).
  9. Attendez que la colle sèche (15 minutes).
  10. Utilisez une aiguille chauffée 26G de faire huit trous suture perforation de l'extérieur (où le verre est) à l'intérieur de la base. Les trous devraient être réparties uniformément autour de la lamelle, 0,5-1mm du bord de la lamelle.
  11. Élargir les trous à l'aide d'une aiguille 5-0 suture.
  12. Perforant des trous dans la base en plastique feront la surface interne inégale. L'utilisation de papier de sable, font de cette surface complètement lisse.
  13. Changer les gants et une brosse de petites particules de plastique de la MIW utilisant une petite brosse.
  14. Laver la MIW à l'eau déminéralisée.
  15. Laver la MIW utilisant 70% d'éthanol. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le verre de sorte qu'il est complètement transparent. S'il ya des taches de brouillard présents de la vapeur de colle, bien utiliser de l'acétone avec un Q-tip.
  16. Stériliser le MIW par l'exposition aux UV pendant 3 heures à chaque côté.

Semi-manuel de fabrication de la fenêtre d'imagerie mammaire (MIW):

Pour fabriquer la base en plastique, nous sommes actuellement en utilisant des moules en silicone coulée créés à l'aide faite à la main MIWs. Le moule est composé de deux parties de caoutchouc de silicone qui font une réplique exacte de l'avant et l'arrière de l'original lorsqu'il est rempli de résine de polyester et puis immédiatement réunis. La résine polyester liquide est mélangé 09h10 et les résultats dans une structure dure lorsqu'il est complètement séché en 48h. Le plastique est protégé contre les UV et les archives sans se décomposer ou de devenir jaune au cours du temps.
Après que la base est guéri, les étapes sont réalisées 02.08 à 02.16 de la même manière que pour MIWs manuellement fait.

3. Insertion de l'MIW:

  1. La zone autour du mamelon 4 e doit avoir un petit (diamètre 5-7 mm) de tumeurs plusieurs jours / semaines après l'injection des cellules tumorales en fonction du type cellulaire (figure 1B). Combien de temps s'est écoulé après l'injection de cellules exprimant la protéine Dendra2 photoswitchable ou d'autres protéines fluorescentes dépend de la lignée cellulaire utilisée. La tumeur ne doit pas être visiblement nécrotiques, et devrait avoir une peau intacte avec des cheveux sur le dessus de la tumeur. Souris présentant des tumeurs nécrosées doivent être euthanasiés.
  2. Préparez l'espace stérile pour la chirurgie-fixer un morceau de tissu stériles à l'intérieur d'une hotte stérile. Placer un morceau de stériles gauze dans le milieu, et de jeter une MIWs quelques instruments stériles autour de lui: nous utilisons la norme petits ciseaux, les ciseaux à ressort, pinces microdissecting, forceps microdissecting, porte-aiguille. Gardez stériles Q-tips, une bouteille d'éthanol à 70% et des gants stériles dans le coin de la hotte.
  3. La souris est anesthésiée dans la hotte stérile à l'aide d'injection IP de 2,5% Avertin (20 pi / g) dans HBSS, ou encore 10 ug / kg de kétamine + 10 pg / g de xylazine (contactez votre Institut en soins des animaux pour les approbations et de la commande).
    Note: La solution doit être préparée Avertin bi-hebdomadaire, stérilisée par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocké que 500 aliquotes à 4 ° C (dans l'obscurité).
  4. Enlever les poils par le rasage de la zone au-dessus de la tumeur en utilisant un rasoir de petits animaux.
  5. Retirer le reste de la chevelure à l'aide de crème d'épilation Nair (disponible en pharmacie). Nettoyer la peau à l'aide d'éthanol par immersion Q-tips.
  6. Transfert de l'animal sur la gaze stérile et appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour les empêcher de sécher et de l'infection.
  7. Stériliser la peau avec de la Bétadine et propre avec de l'éthanol à 70%.
  8. Transfert de l'animal sur un chiffon chirurgical stérile intérieur de la hotte stérile.
  9. Tirez la peau immédiatement en dedans du mamelon aide de pinces et couper ~ incision de 2mm dans la peau.
  10. Séparez les sous-tendent pad mammaires graisse de la peau avec des ciseaux de dissection et une pince. La peau et étirer le trou lors de cette étape de séparation à une taille qui va accueillir l'insertion de la MIW.
  11. Si par hasard un navire est touché pendant l'intervention chirurgicale, de façon stérile Q-tips pour enlever toute trace de sang qui est produit / d'arrêter l'hémorragie de devenir excessif.
  12. Insérez la MIW telle qu'il n'y ait la peau sur le dessus de la base de MIW et la suture en place à l'aide non-résorbables fil et inverser la coupe aiguille.
  13. Utilisez le tissu adhésif ou cyanoacrylate pour combler les trous de suture et sécuriser le MIW à la peau.
  14. Ajouter au TMP-SMX mélange d'antibiotiques: (sulfaméthoxazole 0,6 mg / ml, 0,12 mg triméthoprime / ml) dans la bouteille d'eau en cage pendant 3 jours avant et après la chirurgie.
  15. L'animal reste sous anesthésie pour 1-4h après injection IP Avertin. Depuis l'opération prend généralement ~ 45min, il est important d'aider l'animal de récupérer par la suite:
  16. Placez un coussin chauffant la main (37 ° C) (disponible en pharmacie) sur le fond de la cage et le couvrir avec de la gaze.
  17. Gardez l'animal sur le dessus du pavé jusqu'à ce qu'il tourne sur le ventre et commence à marcher.
  18. Si l'animal est inconscient depuis plus de 3h, injecter 0,3 ml de HBSS par voie intrapéritonéale pendant la réhydratation.
  19. L'animal est autorisé à récupérer au fil des jours 3-4 prochaines avant la session d'imagerie première a lieu.

4. Construction Boîte Imaging

La boîte d'imagerie assure que la MIW est assis à plat, juste au-dessus de l'objectif du microscope. Il facilite également la température et le contrôle anesthésie par flux d'air constant de l'isoflurane. La boîte est faite de plexiglas et collées ensemble en utilisant soudure plastique. Il est équipé de la platine du microscope spécifique et donc la forme de son fond varie selon le microscope utilisé (figure 2 montre le schéma de la boîte équipée d'étape de Leica microscope SP5).
Dimensions de la boîte en centimètres sont L = 11,4 cm, l = 7,6 cm, h = 4,4 cm (figure 2A). Le fond de la boîte se compose d'une plaque creuse, 12.7x8.4 cm en taille, qui s'inscrit à l'intérieur du stade de Leica SP5 microscope, et deux coulissantes "portes", 5,7 x 5,7 cm_each, qui forment une ouverture circulaire (d = 2,22 cm ) lorsqu'il est fermé. Le MIW s'inscrit dans cette ouverture. La pièce avant contient le trou d'entrée pour la livraison d'anesthésie alors l'une des pièces latérales contient un trou de sortie qui mène à la dépression.
Notez que le condenseur et le support de diapositives doivent être retirés avant le placement boîte d'imagerie.

5. Boîte Imaging Utilisez

  1. Placez l'animal sous anesthésie à l'isoflurane et d'appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux.
  2. Fixez l'échappement d'isoflurane l'appareil d'anesthésie à l'avant boîte de l'imagerie, à l'extérieur de l'orifice d'entrée (figure 2B).
  3. Fixez un second tube à l'orifice de sortie de la boîte de l'imagerie. Ce tube doit être fixé sur le filtre à gaz, puis à la dépression.
  4. Ouvrez le couvercle de la boîte et ouvrez les portes boîte et placer l'animal, côté face MIW le fond, et les portes coulissantes dans la boîte.
  5. Tenez la boîte et d'ajuster les portes du bas pour que la base MIW est détenu et immobilisé entre eux. La base de MIW devrait être au même niveau que les portes boîte d'imagerie, tandis que la lamelle MIW devrait être de quelques millimètres en dessous de ce niveau. Assurez-vous que le positionnement de la MIW entre le bas des portes coulissantes assure que la lamelle (partie vitrée de la MIW) repose à plat, parallèle à la porte en bas de la boîte. Cela permettra d'assurer concentrant appropriée.
  6. Basse l'objectif du microscope, pour permettre à l'espace pour le placement de la boîte surhaut de la platine du microscope.
  7. Placez la boîte sur la platine du microscope, et d'ajuster la scène de telle sorte que la lamelle MIW est au-dessus de l'objectif.
  8. Concentrer l'objectif et de commencer l'imagerie.
  9. Tout en utilisant l'isoflurane, l'animal doit être surveillé par une inspection visuelle de la fréquence de la respiration. Cela peut être fait visuellement, ou par la surveillance de la fréquence des artefacts respiratoires apparaissant lors de l'imagerie de collecte (qui peuvent interférer avec l'acquisition de données). Le système MouseOx oxymétrie de pouls (Starr Sciences de la vie Corp) a été utilisé avec succès. De cette façon, les données peuvent être collectées en continu, sans éteindre les lumières allumées dans la pièce à vérifier sur l'animal.
    Remarque: Après chaque séance d'imagerie, la récupération des animaux devrait être facilitée par un tampon d'emballage petite main de chauffage dans une gaze ou Kimwipes et le mettre sous l'animal dans la cage.
    Remarque: Si un objectif à immersion est utilisé pour l'image à travers la MIW, le milieu d'immersion (glycérol, eau, huile) doit être nettoyé de la fenêtre d'imagerie. Le MIW devrait être inspecté pour déceler toute fissure ou autre dommage qui pourrait survenir lors de l'imagerie. Cela est essentiel pour la collecte des données lors des séances d'imagerie multiples.

6. Photocommutation et l'imagerie de cellules marquées Dendra2

La procédure est décrite pour le microscope confocal Leica SP5, la puissance du laser dans le plan focal, les objectifs et les options disponibles lorsque vous utilisez le logiciel varient d'autres microscopes confocaux ou l'imagerie multiphotonique mis en place, et donc le protocole décrit ci-dessous doit être utilisée comme un guide afin d'optimiser l'expérience sur votre microscope.

  1. En observant la tumeur à travers l'oculaire (10x) avec le filtre de fluorescence verte, de localiser les principaux vaisseaux sanguins qui sont visiblement fluide et à plat dans le même plan focal.
  2. Position un des navires dans le centre du terrain et passer à la détection PMT.
  3. Mettre en place la collecte d'imagerie séquentielle pour deux canaux. Un des canaux utilise 488nm ligne laser (10% de puissance), et recueille la diffusion de la matrice extracellulaire (480-495nm) et d'émission de la forme verte de Dendra2 (505-540nm). Le deuxième canal utilise la ligne du laser 543nm (90% de puissance) et recueille les émissions de la forme rouge de Dendra2 (555-600nm). Collecter des images en 3D pré-photocommutation.
  4. Utilisez l'option de numérisation vers le ROI PHOTOSWITCH une population choisie de cellules en utilisant la ligne du laser 405nm (30% de puissance, les scans 20-40). Recueillir des émissions de la forme rouge de la protéine pour contrôler la commutation.
  5. En utilisant la même routine séquentielle comme dans 6.3, recueillir l'après-commutation des images en 3D.
  6. Si photocommutation plus d'une région dans la tumeur, il est conseillé de prendre des photos à travers les oculaires à l'aide d'une caméra numérique, dans les canaux à la fois vert et rouge (figure 3A, B). Cela aidera à l'orientation au cours des séances d'imagerie ultérieurs.
    Remarque: En outre, les vaisseaux sanguins peuvent être temporairement marqués en utilisant la queue-veineuse injection de dextran fluorescent (Cascade Blue ou Alexa Fluor 647, à la fois 10kDa). Quelques heures après l'injection, les dextranes laissera les vaisseaux sanguins et de façon permanente l'étiquette les macrophages.

Les résultats représentatifs:

La figure 3C montre une zone rectangulaire photoswitched (rouge) orienté orthogonalement par rapport à la cuve de sang (pas de fluorescence). Non-photoswitched cellules sont vertes, tandis que la dispersion de la matrice extracellulaire est le violet. L'image est une projection d'intensité maximale de quatre images le long de l'axe Z. (20-50 um de profondeur).

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Département américain de la Défense (BC075554 à BG et BC061403 à DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 d'JvR; CA100324 à JC, JES et JW; CA77522 à JES, U54CA126511 à JC et BG). Nous remercions D. Entenberg de l'aide pour la microscopie, M. Rottenkolber pour les aider dans la fabrication de la boîte de l'imagerie et J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) pour l'anticorps F4/80.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS w/o Ca, Mg GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14025
DMEM media (MDA-MB-231 cells) GIBCO, by Life Technologies 11965
Isoflurane(Aerrane) Baxter Internationl Inc. # NDC 10019-773-40
SCID mouse National Cancer Institute N/A
Culture dishes BD Biosciences 353003 Custom Order
Circular coverslip 8 mm Scientific, Inc. 8CIR-1-FIS

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References

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Biologie cellulaire numéro 28 la microscopie intravitale photocommutation les protéines fluorescentes fenêtre d'imagerie les métastases intravasation l'invasion microenvironnement
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Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window. J. Vis. Exp. (28), e1278, doi:10.3791/1278 (2009).

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