Summary
Intravital Photoschaltung und Verfolgung von Dendra2-markierten Tumorzellen durch die Mammary Imaging-Fenster ist eine Technik, die uns zur Abbildung der metastatischen Verhalten von Tumorzellen in ausgewählten Tumormikromilieu über einer Zeitskala von Tagen erlaubt.
Abstract
In den letzten zehn Jahren Intravitalmikroskopie von Brusttumoren bei Mäusen und Ratten in Single-Cell-Auflösung
Protocol
1. Generation von fluoreszierenden Tumoren durch Injektion von Tumorzellen in die Brustfettpolster:
- Baue eine Zelllinie, die Dendra2 Protein (als zytoplasmatischen Marker) zu 40 bis 80% Konfluenz.
- Spülen Sie Geschirr mindestens 3-mal mit PBS w / o Ca 2 + oder Mg 2 +.
- 3 ml Trypsin pro 10 cm Schale und bei 37 ° C, bis die meisten der Zellen und dann lösen traf das Gericht gegen eine ebene Fläche, um sie zu schütteln.
- Spülen Sie alle Zellen von der Schüssel, und mit einem Schaber (Gummi Polizist) auf Matrix sowie zu sammeln. Fügen Sie die 5 ml PBS. Nehmen Sie ein Aliquot während der Zentrifugation zu zählen.
- Zentrifugation bei 800 g für 5 min.
- Absaugen und resuspendieren in PBS auf eine Konzentration von 5 - 10x 10 6 / ml. Auf Eis, bis injiziert (injizieren innerhalb von 30 min).
- Legen Sie einen Käfig mit 4-5 Wochen alten weiblichen immundefizienten Mäusen (zB SCID) in einem sterilen Haube.
- Sprühen Sie das Gebiet rund um die 4. (Bauch-) Nippel mit 70% Ethanol.
- Inject 0,1 ml in Brustfettpolster. Wenn ein Assistent gefunden werden kann, kann eine Person mit der Maus in Position zu halten, während der andere fügt die Nadel in die Brustfettpolster. Wenn Sie selbst injiziert werden, legen Sie die Maus unter leichter Betäubung mit Isofluran.
- Sobald der Tumor 5-7 mm gewachsen ist, sollte das Mamma-Imaging Window (MIW) eingefügt werden.
Hinweis: Alternativ für einige Anwendungen, die MIW kann auf der Oberseite des gesunden Brustfettpolster eingefügt werden und die Zellen können dann injiziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Abbildung von transient transfizierten Zellen in einer physiologischen Umgebung.
2. Manuelle Herstellung der Mamma-Imaging Window (MIW):
- MIWs (Abbildung 1A) des Gewebes grade Kunststoff zur Biokompatibilität zu gewährleisten. Für die manuelle Konstruktion verwenden wir 5 oder 10 cm Gerichte.
- Legen Sie Latex-Handschuhe über.
- Erhitzen Sie eine Gewebe-Kulturschale und creat einer gekrümmten Oberfläche, indem Sie einen abgerundeten, harten Gegenstand gegen die beheizte Spiegel (verwenden wir eine 1-Zoll-dremmel Bit für diese).
- Schneiden Sie die Mitte der Teller mit einem beheizten Rasierklinge.
- Mit einem kleinen, kegelförmigen dremmel Bit, um ein Loch in der Mitte des kuppelförmigen Kunststoffboden (6-7mm Durchmesser) zu machen.
- Machen Sie die Ränder der Kunststoffsockel völlig glatt durch Schleifen mit der dremmel und weitere Ablage es.
- File die Spitze des Kunststoff-Basis macht eine ebene Fläche für das Deckglas. Der Durchmesser der eingereichten ebenen Fläche sollte 9-10mm sein.
- Kleben Sie die 8mm runden Deckglas (Nummer 1) auf der Abflachung mit dem Sekundenkleber (Cyanacrylat-Klebstoff).
- Warten Sie, bis der Leim trocken (15 Minuten).
- Verwenden Sie einen beheizten 26G Nadel zu acht Naht Löcher Punktion von außen (wo das Glas) an der Innenseite der Basis zu machen. Löcher sollten gleichmäßig um das Deckglas verteilt werden, .5-1mm vom Rand des Deckglases.
- Erweitern Sie die Löcher mit einem 5:0 Nähen Nadel.
- Punktion Löcher in den Kunststoff-Basis wird die innere Oberfläche uneben. Mit Schleifpapier, machen diese Fläche vollkommen glatt.
- Ändern Sie die Handschuhe und Pinsel von kleinen Kunststoff-Teilchen aus der MIW mit einer kleinen Bürste.
- Waschen Sie die MIW mit entionisiertem Wasser.
- Waschen Sie die MIW mit 70% Ethanol. Verwenden Sie ein Q-Tip auf das Glas sauber, so dass es vollkommen transparent ist. Wenn es neblig-Spots präsentieren aus dem Leim Dampf sind, verwenden Sie sorgfältig Aceton mit einem Q-Tip.
- Sterilisieren der MIW durch UV-Bestrahlung für 3 h auf jeder Seite.
Semi-Manual Herstellung der Mamma-Imaging Window (MIW):
Um die Kunststoff-Basis herzustellen, sind wir derzeit mit Silikonkautschuk Gussformen erstellt mit handgefertigten MIWs. Die Form wird aus zwei Teilen aus Silikonkautschuk, dass eine exakte Nachbildung der Vorder-und Rückseite des Originals, wenn mit Polyester-Harz gefüllt und dann sofort zusammengefügt machen zusammen. Das flüssige Polyesterharz zusammen 9:10 Und gemischte Ergebnisse in eine harte Struktur, wenn vollständig in 48h geheilt. Der Kunststoff ist UV-geschützt und Archivierung ohne zusammenzubrechen oder zu gelb im Laufe der Zeit.
Nachdem das Basissystem ist geheilt, nur wenige Schritte 2,8-2,16 die gleiche Weise wie für manuell-made MIWs getan.
3. Einsetzen der MIW:
- Der Bereich um die 4 th Brustwarze sollte eine kleine (5-7 mm Durchmesser) Tumor mehrere Tage / Wochen nach der Injektion der Tumorzellen abhängig vom Zelltyp (Abbildung 1B). Wie viel Zeit hat nach der Injektion von Zellen, die Dendra2 photoschaltbare Protein oder anderen fluoreszierenden Proteinen ist abhängig von der verwendeten Zelllinie vergangen. Der Tumor sollte nicht sichtbar nekrotisch, und sollte eine intakte Haut mit Haaren auf der Oberseite des Tumors. Mäuse, die mit nekrotischen Tumoren sollte eingeschläfert werden.
- Bereiten Sie die sterile Raum für die Chirurgie-legen ein Stück sterilen Tuch in eine sterile Haube. Legen Sie ein Stück sterile gauze in der Mitte, und legen ein paar MIWs und sterilen Instrumenten herum: Wir verwenden kleine Standard-Schere, Feder Schere, Pinzette microdissecting, microdissecting Pinzetten, Nadelhalter. Halten Sie sterile Wattestäbchen, eine Flasche von 70% Ethanol und sterile Handschuhe in die Ecke der Motorhaube.
- Die Maus ist in die sterile Haube betäubt mit IP Injektion von 2,5% Avertin (20 ul / g) in HBSS oder alternativ 10 ug / kg Ketamin + 10 pg / g Xylazin (kontaktieren Sie Ihren Animal Care Institut für Genehmigungen und Bestellung).
Hinweis: Avertin Lösung zubereitet werden sollte zweimal wöchentlich, sterilfiltriert über einen 0,22 um Filter und gespeichert als 500 ul Aliquots bei 4 ° C (im Dunkeln). - Entfernen Sie Haare durch Rasur im Bereich oberhalb des Tumors mit einem kleinen Tier Rasierer.
- Entfernen Sie den Rest der Haare mit Nair Enthaarungscreme (erhältlich in der Apotheke). Reinigen Sie die Haut mit Ethanol-getaucht Q-Tips.
- Übertragen Sie die Tiere auf die sterile Gaze und gelten Augensalbe in die Augen, um sie vor dem Austrocknen und Infektionen zu halten.
- Sterilisieren Sie die Haut mit betadine und sauber mit 70% Ethanol.
- Übertragen Sie die Tiere auf einen sterilen OP-Tuch im sterile Haube.
- Ziehen Sie die Haut sofort medial um die Brustwarze mit einer Pinzette und schneiden ~ 2mm Schnitt in der Haut.
- Trennen Sie die zugrunde liegenden Brustfettpolster von der Haut mit Dissektion Schere und Pinzette. Die Haut und das Loch dehnen während dieser Trennung Schritt zu einer Größe, die Einführung der MIW beherbergen wird.
- Wenn versehentlich ein Gefäß während sugery getroffen wird, mit einem sterilen Wattestäbchen, um das Blut, die produziert / ist, um die Blutung zu groß wird aufhören zu entfernen.
- Legen Sie die MIW, so dass es der Haut auf der Oberseite des MIW Basis und Naht in Ort mit nicht-resorbierbaren Fäden und rückwärts schneidenden Nadel.
- Verwenden Sie Gewebekleber oder Cyanacrylat in der Naht Löcher zu füllen und befestigen Sie die MIW auf die Haut.
- Add TMP-SMX Antibiotika-Mix: (Sulfamethoxazol 0,6 mg / ml, Trimethoprim 0,12 mg / ml) in den Käfig Wasserflasche für 3 Tage vor und nach der Operation.
- Das Tier bleibt in Narkose für 1-4h nach Avertin IP Injektion. Seit der Operation erfolgt häufig ~ 45min, ist es wichtig zu helfen, das Tier danach wieder her:
- Legen Sie eine Hand Heizkissen (37 ° C) (erhältlich in Drogerien) auf dem Boden des Käfigs und decken Sie es mit Gaze.
- Halten Sie das Tier auf der Oberseite des Pads, bis sie auf den Bauch dreht sich um und geht los.
- Wenn das Tier bewusstlos ist seit mehr als 3h, injizieren 0,3 ml HBSS intraperitoneal für Rehydrierung.
- Das Tier darf in den nächsten 3-4 Tage erholen, bevor die erste bildgebende Sitzung stattfindet.
4. Imaging Box Construction
Die Imaging-Box gewährleistet, dass die MIW sitzt flach, rechts oberhalb des Mikroskop-Objektivs. Es erleichtert auch Temperatur-und Anästhesie-Kontrolle durch konstanten Luftstrom von Isofluran. Die Box ist aus Plexiglas und verklebt mit Kunststoff zu schweißen. Es ist für die spezifische Mikroskoptisch montiert und damit die Form seines Bodens variiert je nach Mikroskop (Abbildung 2 zeigt das Schema der Box ausgestattet, Leica SP5 Mikroskoptisch).
Abmessungen der Box in Zentimetern l = 11,4 cm, B = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Abbildung 2A). Die Unterseite der Box besteht aus einem hohlen Platte, 12.7x8.4 cm groß, die innerhalb der Leica SP5 Mikroskoptisch passt, und zwei Schiebetüren "Türen", 5,7 x 5,7 cm_each, die eine kreisförmige Öffnung (Form d = 2,22 cm ), wenn sie geschlossen. Die MIW passt in diese Öffnung. Das Vorderteil enthält das Einlassloch für die Anästhesie während einer der Seitenteile enthält eine Steckdose Loch, um das Vakuum führt.
Beachten Sie, dass der Kondensator und der Diahalter vor dem Imaging-Box Platzierung entfernt werden müssen.
5. Imaging Box verwenden
- Legen Sie das Tier in Narkose mit Isofluran und gelten Augensalbe in die Augen.
- Bringen Sie die Isofluran-Abgas aus dem Narkosegerät zur Bildgebung Feld vor, auf der Außenseite der Einlass-Loch (Abbildung 2B).
- Bringen Sie eine zweite Röhre, die Auslassöffnung des Imaging-Box. Dieses Rohr sollte, um das Gas-Filter und dann das Vakuum angeschlossen werden.
- Öffnen Sie den Karton Deckel und die Box zu öffnen Türen und platzieren Sie das Tier, MIW Seite nach unten, und schieben Sie die Türen in die Box.
- Halten Sie die Box und stellen Sie den unteren Türen, so dass die MIW Basis gehalten wird und immobilisiert zwischen ihnen. Die MIW Base sollte auf dem gleichen Niveau wie die Bildgebung box Türen, während der MIW Deckglas nur wenige Millimeter unterhalb dieser Ebene sein sollte. Stellen Sie sicher, dass die Positionierung der MIW zwischen dem unteren Schiebetüren sorgt dafür, dass das Deckglas (Glas Teil der MIW) flach, parallel zum Boden Türen der Box. Dies gewährleistet eine korrekte Fokussierung.
- Senken Sie die Mikroskop-Objektiv, um Platz für die Platzierung der Box ermöglichen aufSpitze des Mikroskops.
- Legen Sie die Box auf dem Mikroskoptisch, und passen Sie die Bühne, so dass die MIW Deckglas über dem Ziel.
- Fokus der objektiven und starten Bildgebung.
- Bei der Verwendung von Isofluran, sollte das Tier durch visuelle Inspektion der Atemfrequenz überwacht werden. Dies kann visuell erfolgen, oder durch die Überwachung der Atemfrequenz Artefakten bei der Bildgebung Sammlung (diese können mit der Datenerfassung stören). Die MouseOx Pulsoxymetrie-System (Starr Life Sciences Corp) wurde erfolgreich eingesetzt. Auf diese Weise können die Daten kontinuierlich, ohne die Lichter in den Raum, um auf das Tier zu überprüfen gesammelt werden.
Hinweis: Nach jedem Imaging-Sitzung, Tier-Erholung sollte durch Umwickeln eine kleine Hand Heizkissen in Gaze oder Kimwipes und legt es unter das Tier in den Käfig erleichtert werden.
Hinweis: Wenn ein Eintauchen Ziel ist es, Bild durch die MIW verwendet, das Immersionsmedium (Glycerin, Wasser, Öl) sollen von der Imaging-Fenster reinigen. Die MIW sollten keine Risse oder andere Schäden, die während der Bildgebung aufgetreten sind inspiziert werden. Dies ist entscheidend für die Erhebung von Daten während mehrerer Imaging-Sitzungen.
6. Photoschalten und Bildgebung von Dendra2-markierten Zellen
Das Verfahren ist für die Leica SP5 konfokalen Mikroskop beschrieben; der Laserleistung in der Brennebene, zur Verfügung Ziele und Software-Optionen variieren, wenn andere konfokalen Mikroskopen oder Multiphotonen-Imaging einzurichten und damit die unten beschriebenen Protokoll sollte als Leitfaden verwendet werden, um zu optimieren das Experiment auf dem Mikroskop.
- Durch die Beobachtung des Tumors durch das Okular (10x) mit dem grünen Fluoreszenz-Filter, suchen große Blutgefäße, die sichtbar fließen und die Verlegung in die gleiche Brennebene flach.
- Position eines der Gefäße in der Mitte des Feldes, und wechseln Sie PMT-Detektion.
- Set up sequentielle Bildgebung Sammlung für zwei Kanäle. Einer der Kanäle verwendet 488nm Laser-Linie (10% Leistung), und sammelt Streuung von extrazellulären Matrix (480-495nm) und Emission aus der grünen Form von Dendra2 (505-540nm). Der zweite Kanal wird die 543nm Laser-Linie (90% Leistung) und sammelt Emission der roten Form von Dendra2 (555-600nm). Sammeln Sie 3D-Bilder vor Photoschaltung.
- Verwenden Sie den ROI-Scan-Option zu einem ausgewählten Population von Zellen mit dem 405nm Laser-Linie (30% Leistung, 20-40 Scans) Photoschalter. Sammeln Emission der roten Form des Proteins an die Vermittlungsstelle zu überwachen.
- Mit der gleichen sequentiellen Routine wie in 6.3, sammeln post-Umschaltung von 3D-Bildern.
- Wenn Photoschaltung mehr als eine Region in den Tumor, ist es ratsam, Bilder durch die Okulare mit einer digitalen Kamera aufnehmen, in grün und rot-Kanäle (Abbildung 3A, B). Dies wird in der Orientierung während der nachfolgenden Abbildung Sitzungen helfen.
Hinweis: Zusätzlich Blutgefäße kann vorübergehend zu kennzeichnen mit tail-Injektion von fluoreszierenden Dextran (Cascade Blue oder Alexa Fluor 647, beide 10kDa). Ein paar Stunden nach der Injektion wird Dextrane lassen die Blutgefäße und dauerhaft beschriften Sie die Makrophagen.
Repräsentative Ergebnisse:
3C zeigt eine rechteckige photoswitched Region (red) orthogonal in Bezug auf das Blutgefäß (keine Fluoreszenz). Non-photoswitched Zellen sind grün, während die Streuung von der extrazellulären Matrix ist violett. Image ist ein Maximum Intensity Projection von vier Bildern entlang der Z-Achse (20-50 um Tiefe).
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Acknowledgments
(; CA100324 um JC, JES und JW; U54GM064346 zu JvR CA77522 zu JES, U54CA126511 um JC und BG) Diese Arbeit wurde vom US Department of Defense (BC075554 zu BG und BC061403 zu DK), US-amerikanischen National Institutes of Health unterstützt. Wir danken D. Entenberg um Hilfe bei der Mikroskopie, M. Rottenkolber um Hilfe bei der Herstellung der Imaging-Box und J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) für die F4/80 Antikörper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
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