Summary
Photoswitching intravitale e tracking di Dendra2 marcato le cellule tumorali attraverso la finestra Imaging mammaria è una tecnica che ci permette di immagine il comportamento metastatico delle cellule tumorali in microambienti tumorali scelto su una scala temporale di giorni.
Abstract
Nell'ultimo decennio, la microscopia intravitale dei tumori al seno in topi e ratti a singola cella di risoluzione
Protocol
1. Generazione di tumori fluorescenti con iniezione di cellule tumorali nel tappetino mammaria grasso:
- Crescere una linea cellulare che esprime Dendra2 proteine (come marcatore citoplasmatica) al 40 - 80% confluenza.
- Lavare i piatti almeno 3 volte con PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +.
- Aggiungere 3 ml di tripsina per 10 piatti cm e incubare a 37 ° C fino a quando la maggior parte delle cellule staccare e poi ha colpito il piatto contro una superficie piana per scuoterlo.
- Risciacquare tutte le cellule fuori il piatto, e utilizzare un raschietto (poliziotto in gomma) per raccogliere matrice come bene. Aggiungere il 5 ml di PBS. Prelevare un 'aliquota di contare durante la centrifugazione.
- Centrifugare a 800 g per 5 min.
- Aspirare e risospendere in PBS alla concentrazione di 5 - 10x 10 6 / ml. Negozio su ghiaccio fino iniettata (iniezione entro 30 min).
- Inserire una gabbia contenente 4-5 settimana di vita femminile topi immunodeficienti (SCID ad esempio) all'interno di una cappa sterile.
- Spruzzare l'area intorno al 4 ° (addominale) capezzolo con etanolo al 70%.
- Iniettare 0,1 ml nel cuscinetto adiposo della mammella. Se un assistente può essere trovato, una persona può tenere il mouse in posizione mentre gli inserti di altri l'ago all'interno del cuscinetto di grasso mammario. Se si inietta da soli, mettere il mouse sotto anestesia con isoflurano luce.
- Una volta che il tumore è cresciuto fino a 5-7 mm, la finestra Imaging mammaria (MIW) deve essere inserito.
Nota: in alternativa, per alcune applicazioni, la MIW può essere inserito in cima alla sana pad mammaria grasso e le cellule possono essere iniettati in seguito. Questo approccio consente di imaging di cellule trasfettate transitoriamente in un ambiente fisiologico.
2. Fabbricazione manuale della finestra Imaging mammaria (MIW):
- MIWs (Figura 1A) sono fatti di plastica tessuto grado di garantire la biocompatibilità. Per la costruzione manuale, usiamo 5 o 10 piatti cm.
- Mettere i guanti in lattice su.
- Riscaldare un tessuto-cultura piatto e creat una superficie curva premendo un arrotondati, oggetto duro contro il piatto riscaldato (usiamo un 1-pollice bit dremmel per questo).
- Tagliare il centro del piatto con una lama di rasoio riscaldato.
- Utilizzare un piccolo, a forma di cono po dremmel per fare un buco nel centro della cupola a forma di base plastica (6-7mm di diametro).
- Rendere i bordi della base in plastica completamente liscia da carteggiatura con il dremmel e ulteriormente archiviazione.
- File in cima alla base in plastica facendo una superficie piana per il vetro coprioggetti. Il diametro della depositato superficie piana e deve essere 9-10mm.
- Incollare la circolare 8 millimetri di vetro coprioggetto (numero 1) sulla superficie appiattita con il colla (cianoacrilato).
- Attendere che la colla si asciughi (15 minuti).
- Utilizzare un ago riscaldato 26G per fare otto fori sutura pungere da fuori (dove il vetro è) all'interno della base. Fori devono essere distribuite uniformemente in tutto il coprioggetti, 0,5-1mm di distanza dal bordo del vetrino.
- Allargare i fori con un 5-0 ago sutura.
- Pungere fori nella base di plastica farà la superficie interna irregolare. Con carta vetrata, fanno di questa superficie completamente liscia.
- Cambiare i guanti e pennello di piccole particelle di plastica dal MIW con un pennello di piccole dimensioni.
- Lavare la MIW con acqua deionizzata.
- Lavare la MIW utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare un Q-tip per pulire il vetro quindi è completamente trasparente. Se ci sono macchie di nebbia presenti dal vapore colla, con attenzione l'uso di acetone con un Q-tip.
- Sterilizzare il MIW dall'esposizione ai raggi UV per 3 ore a ogni lato.
Semi-manuale di fabbricazione della finestra Imaging mammaria (MIW):
Al fine di fabbricare la base in plastica, stiamo attualmente utilizzando stampi in gomma siliconica creati utilizzando hand-made MIWs. Lo stampo è composto da due parti di gomma di silicone che lo rendono una replica esatta della parte anteriore e posteriore della originale quando è riempita di resina poliestere e poi subito uniti. La resina poliestere liquido è mescolato 9:10 e si traduce in una struttura difficile quando è completamente guarito in 48h. La plastica è protetto UV e l'archiviazione senza rottura verso il basso o di diventare giallo nel corso del tempo.
Dopo che la base è curato, a pochi passi 2,8-2,16 sono fatti allo stesso modo per MIWs manualmente-made.
3. Inserimento del MIW:
- L'area intorno al capezzolo 4 ° dovrebbe avere un piccolo (diametro 5-7 mm) del tumore diversi giorni / settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali a seconda del tipo di cellula (Figura 1B). Quanto tempo è passato dopo l'iniezione di cellule che esprimono proteine Dendra2 photoswitchable o altre proteine fluorescenti dipende dalla linea cellulare utilizzato. Il tumore non deve essere visibilmente necrotico, e dovrebbe avere una pelle intatta con i capelli sulla parte superiore del tumore. I topi con tumori necrotico dovrebbe essere eutanasia.
- Preparare lo spazio sterile per la chirurgia stabilire un pezzo di panno sterile all'interno di una cappa sterile. Mettete un pezzo di sterile gauze nel mezzo, e c'era una MIWs pochi e strumenti sterili attorno ad esso: usiamo piccole forbici standard, primavera forbici, pinzette microdissecting, pinze microdissecting, porta aghi. Mantenere sterile Q-tips, una bottiglia di etanolo al 70% e guanti sterili in un angolo della cappa.
- Il mouse è anestetizzata nella cappa sterile utilizzando l'iniezione IP del 2,5% Avertin (20 l / g) in HBSS o, in alternativa 10 mcg / kg di ketamina + 10 mcg / g xylazina (contattare l'Istituto cura degli animali per le approvazioni e dell'ordine).
Nota: la soluzione deve essere preparata Avertin bi-settimanale, filtro sterilizzato usando un filtro di 0,22 micron e memorizzati fino a 500 aliquote microlitri a 4 ° C (al buio). - Eliminare i peli con la rasatura nella zona sopra il tumore con un rasoio piccolo animale.
- Rimuovere il resto dei capelli con crema di rimozione dei capelli Nair (disponibile in farmacia). Pulire la pelle con etanolo immerso Q-tips.
- Trasferire l'animale sulla garza sterile e applicare una pomata oftalmica agli occhi per evitare che l'essiccazione e infezioni.
- Sterilizzare la pelle con Betadine e pulite, con etanolo al 70%.
- Trasferire l'animale su un panno sterile chirurgica all'interno della cappa sterile.
- Tirare la pelle immediatamente mediale al capezzolo con pinze e tagliare ~ incisione 2 millimetri nella pelle.
- Separare il sottostante pad mammaria grasso della pelle con le forbici e pinze dissezione. La pelle e tratto foro durante questa fase di separazione a una dimensione che ospiterà l'inserimento del MIW.
- Se accidentalmente un vaso viene colpito durante sugery, utilizzare una sterile Q-tips per rimuovere il sangue che viene prodotto / per fermare l'emorragia di diventare troppo oneroso.
- Inserire il MIW tale che ci sia la pelle sulla parte superiore della base MIW e sutura in posizione con filo non riassorbibile e invertire il taglio ago.
- Uso del tessuto adesivo o cianoacrilato per riempire i buchi sutura e fissare il MIW alla pelle.
- Aggiungi TMP-SMX mix di antibiotici: (Sulfametossazolo 0,6 mg / ml, trimetoprim 0,12 mg / ml) nella gabbia bottiglia d'acqua per 3 giorni prima e dopo l'intervento.
- L'animale rimane sotto anestesia per 1-4h dopo l'iniezione IP Avertin. Dal momento che l'intervento richiede normalmente ~ 45 minuti, è importante per aiutare l'animale recuperare in seguito:
- Posizionare una piastra elettrica a mano (37 ° C) (disponibile nelle farmacie) sul fondo della gabbia e coprire con garza.
- Tenere l'animale in cima al pad fino a quando non si accende il suo stomaco e inizia a camminare.
- Se l'animale è incosciente per più di 3 ore, iniettare 0,3 ml di HBSS intraperitoneale per la reidratazione.
- L'animale è consentito di recuperare nei giorni prossimi 3-4 prima della sessione di imaging ha luogo la prima.
4. Imaging Box Costruzione
La casella di imaging assicura che il MIW è seduto piatto, proprio sopra l'obiettivo microscopio. Esso facilita anche la temperatura e il controllo costante del flusso d'aria attraverso l'anestesia di isoflurano. La scatola è realizzata in plexiglass e incollati tra loro con saldatura di plastica. E 'dotato per il palcoscenico microscopio specifico e quindi la forma del suo fondo varia a seconda del microscopio utilizzato (Figura 2 mostra lo schema della scatola fitted di mettere in scena Leica microscopio SP5).
Dimensioni della scatola in centimetri sono L = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Figura 2A). La parte inferiore della finestra consiste in una piastra vuota, 12.7x8.4 cm, che si inserisce all'interno della fase di microscopio Leica SP5, scorrevoli e due "porte", 5,7 X 5,7 cm_each, che formano una apertura circolare (d = 2,22 centimetri ) quando è chiuso. Il MIW si inserisce in questa apertura. Il frontale contiene il foro d'ingresso per l'anestesia, mentre uno dei pezzi lato contiene un foro di uscita che porta al vuoto.
Si noti che il condensatore e il supporto diapositive devono essere rimossi prima del posizionamento casella di imaging.
5. Box Imaging Usa
- Posto l'animale in anestesia con isoflurano e applicare una pomata oftalmica per gli occhi.
- Collegare lo scarico isoflurano dalla macchina per anestesia al fronte casella di imaging, sulla parte esterna del foro di ingresso (Figura 2B).
- Collegare un secondo tubo al foro di uscita della scatola di imaging. Questo tubo deve essere collegato al filtro del gas e poi il vuoto.
- Aprire il coperchio della scatola e aprire le porte box e posto l'animale, MIW lato rivolto verso il basso, e facendo scorrere le porte nella casella.
- Tenere la scatola e regolare le porte in basso in modo che la base MIW è detenuto e immobilizzato tra di loro. La base MIW dovrebbe essere allo stesso livello come le porte casella di imaging, mentre il coprioggetto MIW dovrebbe essere solo pochi millimetri sotto di questo livello. Assicurarsi che il posizionamento del MIW tra la parte inferiore porte scorrevoli assicura che il coprioggetto (porzione di vetro della MIW) in posizione orizzontale, parallelo alle porte fondo della scatola. Questo farà sì messa a fuoco corretta.
- Abbassare l'obiettivo microscopio, per consentire lo spazio per il posizionamento del box aparte superiore del palco microscopio.
- Porre il recipiente sul palco microscopio, e regolare la fase in modo che il coprioggetto MIW è sopra l'obiettivo.
- Mettere a fuoco l'obiettivo e iniziare imaging.
- Durante l'utilizzo di isoflurano, l'animale deve essere controllata mediante ispezione visiva della frequenza respiratoria. Questo può essere fatto visivamente, o attraverso il monitoraggio della frequenza del respiro artefatti che appaiono durante la raccolta di immagini (che possono interferire con l'acquisizione dati). L'ossimetria MouseOx impulso di sistema (Starr vita Sciences Corp) è stato utilizzato con successo. In questo modo i dati possono essere raccolti continuamente senza accendere le luci nella stanza per controllare l'animale.
Nota: Dopo ogni sessione di imaging, il recupero degli animali dovrebbe essere agevolata avvolgendo una piccola piastra elettrica a mano in garza o Kimwipes e metterlo sotto l'animale in gabbia.
Nota: Se un obiettivo ad immersione viene utilizzata per l'immagine attraverso la MIW, il mezzo di immersione (glicerolo, acqua, olio) dovrebbe essere rimosso dalla finestra di imaging. Il MIW deve essere ispezionato per eventuali crepe o altri danni che potrebbero essersi verificati durante l'imaging. Questo è fondamentale per la raccolta di dati durante le sessioni di immagini multiple.
6. Photoswitching e l'imaging di Dendra2 marcato le cellule
La procedura è descritta per il microscopio confocale Leica SP5, la potenza del laser sul piano focale, gli obiettivi e le opzioni software disponibili variano se si utilizzano altri microscopi confocale o immagini multiphoton impostare, e quindi il protocollo descritto di seguito deve essere utilizzato come una guida per ottimizzare l'esperimento sul microscopio.
- Osservando il tumore attraverso l'oculare (10x) con il filtro fluorescenza verde, individuare i vasi sanguigni principali che sono visibilmente fluide e ben distesa sullo stesso piano focale.
- Posizione di una delle navi nel centro del campo e passare alla rilevazione PMT.
- Impostare insieme sequenziale di imaging per due canali. Uno dei canali utilizza 488nm linea laser (10% di potenza), e raccoglie scattering da matrice extracellulare (480-495nm) e le emissioni dalla forma verde di Dendra2 (505-540nm). Il secondo canale utilizza la linea di laser a 543nm (90% di potenza) e raccoglie le emissioni dalla forma rossa di Dendra2 (555-600nm). Raccogliere immagini 3D pre-photoswitching.
- Utilizzare l'opzione ROI scansione photoswitch una popolazione di cellule scelto utilizzando la linea laser di 405nm (30% di potenza, scansioni 20-40). Raccogliere emissione della forma rossa della proteina di monitorare la commutazione.
- Utilizzando la stessa routine sequenziale come in 6.3, raccolta post-switching immagini 3D.
- Se photoswitching più di una regione nel tumore, si consiglia di scattare foto attraverso la oculari utilizzando una fotocamera digitale, in entrambi i canali verde e rosso (Figura 3A, B). Questo aiuterà l'orientamento durante le sessioni di imaging successive.
Nota: Inoltre, i vasi sanguigni può essere temporaneamente etichettato con coda vena iniezione di destrano fluorescente (Cascade blu o Alexa Fluor 647, entrambi 10kDa). Poche ore dopo l'iniezione, destrani lascerà i vasi sanguigni e in modo permanente l'etichetta macrofagi.
Rappresentante dei risultati:
Figura 3C mostra una regione rettangolare photoswitched (rosso) orientata ortogonalmente rispetto al vaso sanguigno (non fluorescenza). Non photoswitched cellule sono verdi, mentre la dispersione della matrice extracellulare è viola. L'immagine è una proiezione intensità massimo di quattro immagini lungo l'asse Z (20-50 micron di profondità).
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal US Department of Defense (BC075554 di BG e BC061403 a DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 a JVR; CA100324 di JC, JES e JW; CA77522 di JES, U54CA126511 di JC e BG). Ringraziamo D. Entenberg aiuto per microscopia, M. Rottenkolber aiuto nella fabbricazione della scatola di imaging e J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) per l'anticorpo F4/80.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
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