की तैयारी Aplysia संवेदी मोटर neuronal सेल संस्कृतियों

Summary

प्राथमिक संस्कृतियों

Protocol

तैयार (प्रोटोकॉल के अंत में समाधान की संरचना के लिए समाधान अनुभाग देखें)

1. संस्कृति व्यंजन तैयार है. Mattek गिलास नीचे पाली एल Lysine (सोडियम borate में बनाया) के साथ संस्कृति डिश के कोट अच्छी तरह से गिलास. पर्याप्त जोड़ें पूरी तरह से गिलास में अच्छी तरह से कवर और> 1hr (रातोरात छोड़ दिया जा सकता है) के लिए छोड़ दें. अच्छी तरह से कृत्रिम समुद्री जल में (ASW) 4-5 बार rinsing द्वारा पाली - एल Lysine हटा दें. हटाने पिछले कुल्ला करने के बाद, 2 50 l15% mls (नमक के साथ पूरक है और 2mm की अंतिम एकाग्रता में एल glutamine युक्त) / 50% hemolymph जोड़ें. इस संस्कृति के माध्यम डिश में चढ़ाना कोशिकाओं को कम से कम एक घंटे के लिए पहले किया जाना चाहिए ताकि hemolymph कोट पकवान.
2. इथेनॉल के साथ और उपकरण Sylgard बर्तन को साफ करने के लिए, _{उन्हें अच्छी} तरह से 2 0 DDH साथ और कुल्ला तो संस्कृति हुड में एक यूवी प्रकाश के तहत> 1 घंटे के लिए उन्हें जगह है.
3. न्यूरॉन्स की microdissection के लिए तेज इलेक्ट्रोड तैयार. Microelectrode खींचने (जैसे Sutter P-97 ब्राउन ज्वलंत), 1.5 मिमी बाहरी व्यास, 0,86 से 1,12 मिमी भीतरी व्यास और 100 मिमी की लंबाई के साथ ग्लास विंदुक इलेक्ट्रोड खींचने का प्रयोग (जैसे AM प्रणाली सूची # 628000; विश्व प्रेसिजन उपकरण TW150 4, 1.55 / 1.12). मापदंडों का उपयोग करें कि एक लंबे और wispy ऐसे उच्च प्रतिरोध के ठीक टिप है कि तरल पदार्थ का कोई केशिका सेवन जब समाधान में रखा है के साथ एक इलेक्ट्रोड का उत्पादन. एक तरल पदार्थ meniscus की उपस्थिति का मतलब है कि इलेक्ट्रोड टिप अलगाव के दौरान न्यूरॉन नुकसान होगा. Sutter इलेक्ट्रोड रसोई की किताब इलेक्ट्रोड कार्यक्रमों की स्थापना के लिए उत्कृष्ट दिशा निर्देश प्रदान करता है. हम एक बॉक्स फिलामेंट का उपयोग, और एक एक कदम संस्कृति इलेक्ट्रोड उत्पन्न खींच.
4. संवेदनाहारी समाधान (MgCl2 0.35M), संस्कृति मध्यम (l15 लवण और hemolymph के साथ पूरक), और protease समाधान (1% protease प्रकार नौवीं, सिग्मा, यूनिट 1 मिलीग्राम / 10 इकाइयों / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता) तैयार है.
5. जानवर: संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए और LFS मोटर न्यूरॉन्स के वयस्क 80-100 छ Aplysia का उपयोग करें. L7 मोटर न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए किशोर 1-4 जी Aplysia का प्रयोग करें . जानवरों धीरे से समुद्री जल टैंक, निकालें और कोई 30 मिनट से अधिक के लिए समुद्री जल (बीकर, बाल्टी, या प्लास्टिक की थैली में) में बनाए रखने के संज्ञाहरण और संस्कृति प्रक्रिया की शुरुआत से पहले.

संस्कृति प्रक्रिया

80-100 छ Aplysia से ए संवर्धन फुफ्फुस संवेदी न्यूरॉन्स

1. Ganglia के हटाने के लिए पशुओं anesthetize: वयस्क Aplysia (8-10 छ) एक 18 गेज 1.5 इंच सुई के साथ एक 60 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग _कर में 0.35 एम 2 MgCl इंजेक्षन. जानवर के बारे में 35 डिग्री के कोण पर पैर दर्ज करें, और भी गहराई से प्रवेश नहीं. लक्ष्य के लिए आंतरिक अंगों मर्मज्ञ के बिना पशुओं के hemocoel में सुई है. जानवर बहुत distended और आराम से हो जाना चाहिए.
2. Ganglia काटना: एक विदारक डिश पर anesthetized जानवर सिर और पूंछ पर (18 गेज सुई 80-100 छ पशुओं के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं), पिन, और का सामना करना पड़ रहा पैर के साथ, पिन. दांतेदार संदंश के साथ पैर पकड़ो और त्वचा के माध्यम से और एक शल्य कैंची के साथ अंतर्निहित संयोजी ऊतक पैर की पूरी लंबाई (सिर से पूंछ के लिए) काट. दोनों पक्षों नीचे पिन. एक संदंश और कैंची का प्रयोग, घेघा में कटौती और पक्ष को खींचने के लिए ganglia बेनकाब. एक ठीक संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, बाहर फुफ्फुस पेडल ganglia (संवेदी न्यूरॉन्स फुफ्फुस ganglia में हैं) में कटौती. तंत्रिका की एक निष्पक्ष राशि छोड़ दो इस के बाद से यह आसान नीचे पिन protease उपचार के बाद ganglia बनाता है.
3. Ganglia के Protease पाचन: protease समाधान में ganglia प्लेस (10 / 1 / l15 में इकाई मिलीग्राम मिलीग्राम मिलीलीटर) 34.5 पर एक मशीन सेट में डिग्री सेल्सियस (34-35 ° सी ठीक है) 2 बजे और 15min के लिए. ठीक टिप का उपयोग तीन बार करने के लिए स्थानांतरण और ASW में ganglia धोने संदंश. L15 में ganglia रखें. ध्यान दें कि protease ऊष्मायन समय भिन्न हो सकते हैं. उद्देश्य के लिए संयोजी ऊतक को आसानी से हटाया जा करने की अनुमति है. यदि यह बहुत मुश्किल न्यूरॉन्स को नुकसान पहुँचाए बिना ganglia desheath है, protease ऊष्मायन समय वृद्धि हुई है. "सॉफ्ट" protease ऊष्मायन समय को कम अगर यह अत्यंत desheath के लिए आसान है ganglia, और न्यूरॉन्स हैं.
4. Desheathing ganglia: एक 60 मिमी या 35 मिमी पकवान युक्त sylgard और l15 protease-पचा ganglia स्थानांतरण. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (बाह्य हलोजन रोशनी के साथ) के तहत देखना, ganglia पेडल को हटाने और नीचे उचित ओरिएंटेशन का उपयोग कीट पिन और एक ठीक संदंश में Sylgard पकवान में फुफ्फुस ganglia पिन. ठीक संदंश और एक Vanna शल्य कैंची के साथ, ध्यान से संयोजी ऊतक लिफ्ट और यह संवेदी क्लस्टर को बेनकाब करने के लिए काट. या कभी छू नहीं neuronal somata क्षति के लिए सावधान रहें. किसी भी अतिरिक्त संयोजी ऊतक को पकवान से निकालें और अधिक मध्यम जोड़ने के लिए, हवा को बेनकाब करने के लिए कभी desheathed नाड़ीग्रन्थि सुनिश्चित करने. संवेदी क्लस्टर लगभग 40-50 माइक्रोन व्यास के 200 क्लस्टर न्यूरॉन्स के होते हैं. एक पिन सेट करने के लिए एक छोटी दूरी पर gangl से एक "पोस्ट"आयन (देखने के क्षेत्र के भीतर).
5. न्यूरॉन्स के अलगाव: लंबे, तेज कांच संस्कृति इलेक्ट्रोड का उपयोग करना, पहचान सिर्फ केंद्र बंद सेल शरीर को छू (कोचना नहीं है), और धीरे धीरे और तेजी से सेल सोम खींच द्वारा एक न्यूरॉन्स पुल, अक्षतंतु के साथ एक साथ, से दूर नाड़ीग्रन्थि. धीरे पिन के खिलाफ नल इलेक्ट्रोड से न्यूरॉन्स बेदखल.
6. चढ़ाना न्यूरॉन्स: एक pipetman (P10) का प्रयोग Sylgard पकवान से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स एक संस्कृति डिश को हस्तांतरण. टिप ताकि प्लास्टिक टिप hemolymph के साथ लेपित है में न्यूरॉन्स, pipet संस्कृति के माध्यम स्थानांतरित करने से पहले (इस प्लास्टिक के लिए चिपके से न्यूरॉन्स रोकता है). किसी भी हवाई बुलबुले या किसी भी चरम बलों (यानी बहुत धीरे से ऊपर ले और pipetteman से न्यूरॉन्स हटायें) न्यूरॉन्स को उजागर करने से बचने के लिए महान ख्याल रखना. न्यूरॉन्स पकवान भर में समान रूप से वितरित. धीरे से सीधे प्रक्रियाओं को एक तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग करें और उन्हें नीचे नीचे नल.
7. ऊष्मायन: कमरे के तापमान पर 3 घंटे से भी कम समय के लिए नहीं खुर्दबीन मंच पर व्यंजन छोड़ो. हम नियमित उन्हें रात भर छोड़ दें. यकीन है कि खुर्दबीन मंच इस अवधि के दौरान बेफिक्र. कवर एल्यूमीनियम पन्नी प्रकाश से बचाने के साथ मंच. धीरे उन्हें एक 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर हस्तांतरण.
8. संस्कृतियों लगभग 3 घंटे के भीतर पकवान का पालन करना और नई neurite वृद्धि लगभग 6-12 घंटे के भीतर दिखाई जानी चाहिए. अलग संवेदी न्यूरॉन्स के विकास DIV 3 या 4 द्वारा एक पठार तक पहुँचता है. नोट करें कि पृथक संवेदी न्यूरॉन्स हरिणी, फार्म autapses या एक दूसरे के साथ रासायनिक synapses नहीं है हालांकि वे फार्म बिजली अंतराल जंक्शनों.

संवेदी न्यूरॉन मोटर न्यूरॉन cocultures बी तैयार

संवेदी न्यूरॉन्स लक्ष्य संस्कृति में मोटर न्यूरॉन्स के साथ synapse के रूप में. सबसे अधिक इस्तेमाल किया मोटर न्यूरॉन्स LFS मोटर न्यूरॉन्स और पेट नाड़ीग्रन्थि से L7 मोटर न्यूरॉन, कर रहे हैं. LFS मोटर न्यूरॉन्स वयस्क (8-10 छ) Aplysia से अलग हैं, और वहाँ पेट नाड़ीग्रन्थि लगभग 20 प्रति LFS मोटर न्यूरॉन्स हैं. L7 मोटर न्यूरॉन किशोर जानवरों (1-4 ग्राम) से अलग है, और वहाँ केवल एक पेट ganglia प्रति L7 है. LFS मोटर न्यूरॉन्स व्यास में 40-50 microns हैं, पेट ganglia के ventral सतह पर अपनाना तंत्रिका की जड़ के करीब ले संवेदी न्यूरॉन्स के बीच interspersed हैं, और एक सूक्ष्म प्रत्येक सोम में अंधेरे वर्णक हाजिर द्वारा विशेषता हैं. L7 मोटर न्यूरॉन व्यास में 100-150 microns और नाड़ीग्रन्थि के पृष्ठीय नाड़ीग्रन्थि के बाईं ओर के बीच बढ़त पर, सतह पर मौजूद है. हालांकि यह अधिक किफायती है LFS मोटर न्यूरॉन्स उपयोग L7 मोटर न्यूरॉन के बड़े आकार के कुछ प्रयोगों के लिए फायदेमंद है. पेट नाड़ीग्रन्थि, L7 के लिए दुम के पृष्ठीय बाईं सतह पर भी L11 मोटर न्यूरॉन, एक nontarget मोटर न्यूरॉन है और प्रभावी ढंग से एक नियंत्रण के साथ जो संवेदी न्यूरॉन fasciculates लेकिन रासायनिक synapses के फार्म नहीं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

1. Ganglia को हटाने के लिए पशुओं anesthetize. LFS मोटर न्यूरॉन्स के लिए, के रूप में फुफ्फुस संवेदी न्यूरॉन्स के लिए में वर्णित करते हैं. L7 मोटर न्यूरॉन्स के लिए, किशोर Aplysia (1-4 ग्राम) एक 21 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर में 0.35 _एम 2 MgCl इंजेक्षन .
2. एक विदारक डिश पर anesthetized जानवर पिन के रूप में ऊपर वर्णित (किशोर जानवरों के लिए 21 गेज सुई का उपयोग): पेट ganglia काटना. ठीक संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, बाहर पेट ganglia में कटौती.
3. Ganglia के Protease पाचन: यह किया जाता है के रूप में फुफ्फुस संवेदी न्यूरॉन्स के लिए में वर्णित है, सिवाय इसके कि पाचन के समय किशोर (1-4 ग्राम) जानवरों से ganglia के लिए 1 घंटा 45 मिनट के लिए कम है.
4. Desheathing ganglia: एक 35 या 60 मिमी sylgard और l15 युक्त डिश के लिए स्थानांतरण protease-पचा ganglia. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (बाह्य हलोजन रोशनी के साथ) के तहत देखना, ganglia में उचित ओरिएंटेशन का उपयोग कीट पिन और एक ठीक संदंश में Sylgard डिश में नीचे. ठीक संदंश और एक Vanna शल्य कैंची के साथ, ध्यान से संयोजी ऊतक लिफ्ट और यह neuronal सेल निकायों को बेनकाब करने के लिए कटौती. LFS मोटर न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए, ताकि वेंट्रल सतह का सामना करना पड़ रहा है नाड़ीग्रन्थि पिन, और एक संदंश के साथ संयोजी ऊतक म्यान वापस खींचने के लिए नाड़ीग्रन्थि के पूरे आधे LFS मोटर (अपने अधिकार के लिए) न्यूरॉन्स, desheath वाले का पर्दाफाश नाड़ीग्रन्थि के शेष भागों, पकवान से किसी भी संयोजी ऊतक को हटाने और अधिक l15 जोड़ें. L7 या L11 मोटर न्यूरॉन अलग नाड़ीग्रन्थि ताकि पृष्ठीय सतह का सामना करना पड़ रहा है पिन, और एक संदंश के साथ संयोजी ऊतक म्यान वापस खींचने के लिए दोनों L7 और L11 (अपनी बाईं करने के लिए) युक्त नाड़ीग्रन्थि के आधे का पर्दाफाश. या कभी छू नहीं neuronal somata क्षति के लिए सावधान रहें. नाड़ीग्रन्थि (देखने के क्षेत्र के भीतर) से एक कम दूरी पर एक "पोस्ट" बनाने के लिए एक पिन प्लेस.
5. न्यूरॉन्स के अलगाव: एक तेज संवेदी न्यूरॉन्स के लिए में वर्णित के रूप में इलेक्ट्रोड के साथ न्यूरॉन्स निकालें. LFS न्यूरॉन्स अन्तर हैंउनके somata में एक छोटे से अंधेरे वर्णक स्थान के आधार पर पड़ोसी ले संवेदी न्यूरॉन्स से erentiated. L7 न्यूरॉन L11 पहली न्यूरॉन से विभेदित किया जा सकता है क्योंकि L11 L7 करने के लिए दुम है, क्योंकि L11 सेल शरीर को और अधिक आकार में आयताकार है, जबकि L7 सेल शरीर राउंडर है और क्योंकि L11 अक्षतंतु करीब दो में सेल शाखा आदत शरीर.
6. चढ़ाना न्यूरॉन्स: एक pipetman (P10) का प्रयोग Sylgard पकवान से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स एक संस्कृति डिश के रूप में वर्णित संवेदी न्यूरॉन्स के लिए स्थानांतरण.
7. संवेदी न्यूरॉन्स के साथ बाँधना: चलो कम से कम 1 घंटा के लिए मोटर न्यूरॉन्स पकवान संस्कृति का पालन. फिर एक pipetman के साथ अलग संवेदी न्यूरॉन्स को जोड़ने के लिए, प्रत्येक संवेदी न्यूरॉन एक मढ़वाया मोटर न्यूरॉन के लिए आसन्न पहुंचाने. एक तेज कांच का उपयोग सावधानी से संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु सीधा है, और एक मोटर न्यूरॉन के लिए अगले स्थिति संवेदी सेल शरीर मनाना एक के बराबर या थोड़ा संवेदी सेल अक्षतंतु की लंबाई से भी कम दूरी पर, इलेक्ट्रोड. कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग करना, मनाना संवेदी अक्षतंतु मोटर न्यूरॉन के साथ संपर्क में आने के लिए, बहुत धीरे पतला इलेक्ट्रोड के पक्ष का उपयोग करने के लिए अंत में संवेदी अक्षतंतु शारीरिक संपर्क मोटर न्यूरॉन के अक्षतंतु. संस्कृति पकवान लिफ्ट, बल्कि धीरे खुर्दबीन मंच के साथ पकवान सरकना मत करो.
8. कोई कम से कम 3 बजे और एक 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण के रूप में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए में वर्णित के लिए कमरे के तापमान पर खुर्दबीन मंच पर बर्तन छोड़ दें.
9. संस्कृतियों लगभग 3 घंटे के भीतर पकवान का पालन करना और नई neurite वृद्धि लगभग 6-12 घंटे के भीतर दिखाई जानी चाहिए. संवेदी न्यूरॉन्स मोटर न्यूरॉन्स के साथ glutamatergic synapses बहुत जल्दी फार्म - जैसे ही सेल काफी तेज इलेक्ट्रोड (3-5 बजे) रिकॉर्डिंग, एक उत्तेजक के बाद synaptic संभावित दर्ज किया जा सकता करने के अनुयायी हैं. Synaptic कनेक्टिविटी 3 DIV तक वृद्धि जारी है, और फिर DIV7 जब तक स्थिर है. न्यूरॉन्स संस्कृति में पहली बार एक से तीन दिन के दौरान विस्तृत neurite परिणाम दिखाने चाहिए.

Hemolymph के सी. तैयारी

Hemolymph Aplysia संस्कृति में वृद्धि कारक (स्तनधारी सेल संस्कृति में भ्रूण बछड़ा सीरम का उपयोग करने के लिए अनुरूप) के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह बड़े जानवरों (500 ग्राम -1 किलो) से एकत्र किया जाता है, और वसंत (जून मार्च के मध्य) के दौरान hemolymph इकट्ठा (anecdotally) का सबसे अच्छा समय है. एक डिस्पोजेबल Underpad में पशु लपेटना केवल इतना है कि जानवर के एक छोटे से हिस्से अवगत कराया है, इथेनॉल के साथ त्वचा के उस हिस्से को साफ, और फिर इसे पकड़ है जबकि एक अन्य व्यक्ति को एक बाँझ धार का उपयोग करता है उजागर क्षेत्र में एक चीरा बनाने. निचोड़ जानवर इतना है कि एक स्वच्छ बीकर में hemolymph squirts, यकीन है कि यह जानवर के गंदे त्वचा से संपर्क नहीं करता है. जानवर के hemolymph hemocoel (यानी, जानवर मूल रूप से hemolymph की एक थैली है) भरता है. जानवर एक या दो बार Rewrap, एक नई चीरा बनाने के लिए और हार्ड निचोड़ करने के लिए जितना संभव हो उतना hemolymph इकट्ठा (एक नई बीकर में इकट्ठा इतना है कि अगर यह दूषित हो जाता है, पहला संग्रह अभी भी प्रयोग करने योग्य है). प्रत्येक जानवर से Hemolymph अलग रखा जाना चाहिए (यानी, विभिन्न जानवरों से पूल hemolymph नहीं है). 10 मिनट के लिए 2000 XG पर hemolymph स्पिन रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए. विभाज्य 10 मिलीलीटर aliquots में सतह पर तैरनेवाला, जानवर और दुकान के द्वारा -80 पर लेबल डिग्री सेल्सियस ध्यान दें कि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत hemolymph मध्यम में एक वेग रूपों. Hemolymph की एक नई विभाज्य इस्तेमाल किया जा हर बार संस्कृति के माध्यम तैयार है चाहिए, और विभाज्य मध्यम तैयारी के लिए सिर्फ पहले thawed चाहिए. विगलन के बाद refreeze मत करो.

Discussion

Aplysia संवेदी मोटर संस्कृतियों के सफल तैयारी एक हद तक धीमी गति से सीखने की अवस्था है, क्योंकि यह ठीक मोटर microdissection और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा हेरफेर के साथ जुड़े कौशल के विकास शामिल है. हमारे अनुभव में, यह अभ्यास के लगभग 1-3 सप्ताह लगते संस्कृति में स्वस्थ अलग संवेदी न्यूरॉन्स और एक अतिरिक्त 1-3 सप्ताह प्राप्त करने के लिए सीखना कैसे मोटर न्यूरॉन्स के साथ संवेदी न्यूरॉन्स जोड़ी. हम नियमित रूप से एक Labconco साफ़ पीठ में संस्कृतियों की तैयारी कर रहे हैं, हालांकि यह संभव है उन्हें किसी भी प्रयोगशाला बेंच या डेस्क पर तैयार करते हैं, के रूप में लंबे समय के रूप में संवर्धन (किसी भी कंपन या यांत्रिक गड़बड़ी के पालन से न्यूरॉन्स को रोकने के) के दौरान माइक्रोस्कोप बेफिक्र है. के बाद से न्यूरॉन्स 18 साल की उम्र में समुद्री जल में बढ़ने डिग्री सेल्सियस, बैक्टीरियल और फंगल contaminations काफी कम स्तनधारी सेल संस्कृति की तुलना में आम हैं. संस्कृति तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण चर जानवर की गुणवत्ता है Aplysia या तो विक्रेताओं जो उन्हें प्रशांत महासागर (तत्परता, या Marinus), या मियामी Mariculture सुविधा है, जो प्रजनन जोड़े एकत्र विश्वविद्यालय से सीधे इकट्ठा से खरीदा जा सकता है. प्रशांत से और फिर एक प्रजनन चक्र के माध्यम से Aplysia बढ़ता है. जैसे, आनुवंशिक विषम पशुओं हैं, और सागर से एकत्र पशुओं के मामले में, वे भी अपने पर्यावरण के इतिहास के संदर्भ में heterogenous हैं. Aplysia से प्राप्त न्यूरॉन्स की गुणवत्ता के कुछ सबसे बुरा समय आम तौर पर अगस्त में होने वाली के साथ, मौसम, और एक अन्य कम दिसंबर के आसपास गुणवत्ता की अवधि है. एक अन्य महत्वपूर्ण चर hemolymph है. यह बुद्धिमान है hemolymph की उनकी क्षमता विकास को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न बैचों, परीक्षण और प्रयोगों का एक सेट के लिए hemolymph के एक ही बैच का उपयोग करें.

Aplysia neuronal संस्कृतियों की तैयारी की कठिनाई के बावजूद, वे synapse गठन और synaptic plasticity का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय और मूल्यवान लाभ के एक नंबर के अधिकारी. वे संस्कृति में monosynaptic कनेक्शन है कि दिनों की अवधि के लिए तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग द्वारा नजर रखी जा सकता है फार्म. खैर विशेषता प्रोटोकॉल मौजूद है कि plasticity की रूपों है कि जानवर के व्यवहार में स्पष्ट समानताएं है प्रकाश में लाना. स्नान के लिए या synapses6 के सबसेट, 7 उत्तेजनाओं लागू किया जा सकता है, और संस्कृतियों की ज्यामिति के अलग किया जा सकता है ताकि एक संवेदी न्यूरॉन एक एकल मोटर न्यूरॉन, या एक बंटवारा अक्षतंतु संपर्कों के साथ संवेदी न्यूरॉन दो मोटर न्यूरॉन्स, या दो संवेदी संपर्कों न्यूरॉन्स एक व्यक्ति मोटर न्यूरॉन से संपर्क करें. आण्विक और सेल जैविक रास्ते डीएनए, शाही सेना, siRNA और अन्य अभिकर्मकों के microinjection से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में बदला जा सकता है, और neuronal संरचना और समारोह, synaptic प्रसारण और plasticity पर प्रभाव अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ नजर रखी जा सकता है. NIH और ब्रॉड संस्थान Aplysia जीनोम अनुक्रमण के पूरा होने वाला है, जो चाहिए

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.