Summary
Beschrijven we een snelle en effectieve methode voor de zuivering van mitochondriën van de gist
Abstract
Mitochondriën zijn de belangrijkste site van ATP productie tijdens aërobe metabolisme in eukaryote niet-fotosynthetische cellen
Protocol
Materialen en methoden
Giststammen en groei-omstandigheden
De wild-type stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) werd gekweekt in een rijke YEPD medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose). Cellen werden gekweekt bij 30 ° C met een rotatie schudden bij 200 rpm in erlenmeyers op een 'fles volume / medium volume "ratio van 5:1.
Isolatie van ruwe mitochondriale fractie
- Grow een L van de wild-type stam BY4742 cultuur voor 48 uur
- Giet cultuur in 500 ml Nalgene centrifugebuizen. De balans van de belasting en de oogst cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
- Decanteer supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 250 ml dH2O. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
- Decanteer supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 250 ml dH2O. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
- Bepaal natte gewicht van celpellet.
- Resuspendeer gepelleteerd cellen in DTT buffer [2 ml buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Breng de celsuspensie tot 50-ml Falcon plastic buizen.
- Draai de buizen op 70 toeren per minuut in een shaker gedurende 20 min bij 30 ° C.
- Oogst cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer gepelleteerd cellen in Zymolyase buffer zonder Zymolyase [7 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer gepelleteerd cellen in Zymolyase buffer zonder Zymolyase [7 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Overdracht celsuspensie om een glazen flesje.
- Voeg het poeder van Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (nat gewicht) cellen] om de celsuspensie.
- Draai de fles met celsuspensie op 70 toeren per minuut in een shaker gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
- Overdracht spheroplasts gevormd door de vertering van de celwand met Zymolyase-100T tot 50-ml plastic centrifugebuizen.
- Pellet spheroplasts door middel van centrifugeren gedurende 8 minuten bij 2200 xg bij 4 ° C.
** Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs. Suspensies van spheroplasts moeten worden behandeld zachtjes met pipetten met gesneden tips om te voorkomen dat het breken van organellen .**
- Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Pellet spheroplasts door middel van centrifugeren gedurende 8 minuten bij 2200 xg bij 4 ° C.
- Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Overdracht cellen om een pre-gekoeld op ijs glas homogenisator.
- Met behulp van een strakke stamper, homogeniseren van de cellen door het maken van 15 slagen van de stamper.
- Voeg een volume van ijs-koud homogenisering buffer.
- Overdracht gehomogeniseerd spheroplasts tot 50-ml plastic centrifugebuizen.
- Pellet ongebroken cellen, kernen en grote puin door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 1500 xg bij 4 ° C.
- Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 5 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C.
- Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen].
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij 4 ° C.
- Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml ijskoude SEM buffer.
** Hoewel deze opschorting is verrijkt met mitochondriën, het bevat ook andere organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (microsomen), Golgi, en vacuolen. Om puur mitochondriën, kan dit ruwe mitochondriale fractie worden onderworpen aan verdere fractionering, zoals hieronder beschreven .**
Zuivering van mitochondriën verstoken van besmetting door andere organellen
- Plaats 1,5 ml ijskoude 60% (w / v) sucrose in EM buffer in een Beekman Ultra-Clear centrifugebuis.
- Overlay 60% (w / v) sucrose met 4 ml van 32%, 1,5 ml van 23%, 1,5 ml van 15% sucrose (alle wt / v in EM buffer).
- Plaats 3 ml van het ruwe mitochondriale fractie in SEM buffer op de top van 15% (w / v) sucrose.
- Centrifuge in een Beekman SW41 Ti swingende-bucket rotor gedurende 1 uur bij 134.000 xg (33.000 rpm) bij 4 ° C.
- De intacte mitochondriën vormen een bruine band aan de 60% / 32% sucrose-interface.
- Verwijder voorzichtig sucrose tot aan het bereiken van de mitochondriale band.
- Verwijder de mitochondriale band met behulp van een pipet met een cut tip en plaats deze in een Beekman centrifugebuis voor een MLS-5 rotor.
- Vul de buis met SEM buffer.
- Pellet de zuivere mitochondria door centrifugeren in een MLS-5 rotor gedurende 30 min bij 10.000 xg (31.000 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant met behulp vaneen pipet.
- Gebruik de pure mitochondriën voor de analyse van mitochondriale functies, mitochondriale proteoom en lipidome, en mitochondriale DNA.
Reagentia
- DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM dithiothreitol] (voor 15 ml)
- 1,5 ml van 1 M Tris/H2SO4 buffer (pH 9,4)
- 150 ul van 1 M DTT
- Volume tot 15 ml
- Zymolyase buffer [20 mM kaliumfosfaat (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (voor 100 ml)
- 2 ml van 1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4)
- 60 ml 2 M sorbitol
- Volume op 100 ml
- Homogenisering buffer [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (voor 250 ml]
- 2,5 ml van 1 M Tris / HCl buffer (pH 7,4)
- 75 ml 2 M sorbitol
- 500 pi van 500 mM EDTA
- 0,5 g van de BSA
- Volume tot 250 ml
- SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM sucrose, 1 mM EDTA] (voor 250 ml)
- 2,5 ml van 1 M MOPS / KOH buffer (pH 7,2)
- 31,25 ml van 2 M sucrose
- 500 pi van 500 mM EDTA
- Volume tot 250 ml
- EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (voor 250 ml)
- 2,5 ml van 1 M MOPS / KOH buffer (pH 7,2)
- 500 pi van 500 mM EDTA
- Volume tot 250 ml
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk hoog rendement isolatie van pure mitochondria uit gistcellen. Mitochondria gezuiverd door middel van deze methode zijn in wezen vrij is van besmetting door andere organellen en behouden hun structurele en functionele integriteit na de zuivering. De beschreven methode levert mitochondriën die geschikt zijn voor cel-vrije reconstructie van essentiële mitochondriale processen. Deze zeer zuivere mitochondriën kan ook worden gebruikt voor de analyse van mitochondriale structuur en functies, mitochondriale proteoom en lipidome, en mitochondriale DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de CIHR en de NSERC van Canada. VIT is een CIHR nieuwe onderzoeker en de Concordia University Research Chair in Genomics, Celbiologie en veroudering.
References
- Voet, D., Voet, J. G.
- Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J.
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
