Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Summary

Biz maya mitokondri arıtma için hızlı ve etkili bir yöntem tarif

Abstract

Mitokondri, ATP üretimi ana site ökaryotik olmayan fotosentetik hücrelerde aerobik metabolizma sırasında

Protocol

Gereç ve yöntem

Maya suşları ve büyüme koşulları

Yabani tip suşu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glukoz), zengin bir YEPD ortamda yetişmiştir . Hücreler, 30 ° C dönüş 05:01 "balon hacim / orta hacimli" oranı Erlenmeyer matara 200 rpm'de sallayarak kültüre edildi.

Ham mitokondrial fraksiyon izolasyonu

1. 48 saat için 1 L yabani tip suşu BY4742 kültür büyütün
2. 500 ml Nalgene santrifüj tüplerine kültür dökün. 3000 xg'de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla yük ve hasat hücreleri Dengesi.
3. Durusu supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri dH2O 250 ml. 3000 xg'de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri.
4. Durusu supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri dH2O 250 ml. 3000 xg'de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri.
5. Hücre pelletini ıslak ağırlık belirleyin.
6. DTT tampon [2 ml tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri] pelet hücreleri tekrar
7. 50 ml Falcon plastik tüpler hücre süspansiyonu aktarın.
8. Tüpler, 30 ° C'de 20 dakika için bir çalkalayıcı 70 rpm'de Döndür
9. 3000 xg'de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj Hasat hücreleri.
10. Zymolyase [tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 7 ml] olmadan Zymolyase tampon pelet hücreleri tekrar
11. 3000 xg'de 5 dakika oda sıcaklığında santrifüj yoluyla Pelet hücreleri.
12. Zymolyase [tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 7 ml] olmadan Zymolyase tampon pelet hücreleri tekrar
13. Hücre süspansiyonu bir cam erlene aktarın.
14. Zymolyase-100T tozu ekleyin [1 mg Zymolyase-100T / g (ıslak ağırlık) hücrelerinin] hücre süspansiyonu.
15. , 30 ° C'de 30 dakika için bir çalkalayıcı 70 rpm'de hücre süspansiyonu ile şişesi döndürün
16. Transferi spheroplasts Zymolyase-100T için 50 ml plastik santrifüj tüplerine ile hücre duvarının sindirim nedeniyle kurdu.
17. Pelet 4 2200 xg'de 8 dakika süreyle santrifüj spheroplasts ° C

** Sonraki tüm adımlar, 4 ° C veya buz üzerinde yapılmalıdır. Spheroplasts, Cezalar organelleri kırılma önlemek için kesme uçları ile hafifçe pipetler kullanarak ele alınmalıdır .**

18. Buz gibi soğuk homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml] pelet spheroplasts tekrar
19. Pelet 4 2200 xg'de 8 dakika süreyle santrifüj spheroplasts ° C
20. Buz gibi soğuk homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml] pelet spheroplasts tekrar
21. Buz cam homojenizatör önceden soğutulmuş hücreleri aktarın.
22. Sıkı bir havaneli kullanarak, havaneli 15 vuruş yaparak hücreleri homojenize.
23. Buz homojenizasyon tampon 1 hacim ekleyin.
24. 50 ml plastik santrifüj tüplerine homojenize spheroplasts aktarın.
25. Pelet 4 1500 xg'de 5 dakika santrifüj kesintisiz hücreleri, çekirdek, büyük bir enkaz ° C
26. 4 3000 xg'de 5 dakika süpernatant Santrifüj ° C.
27. 4 ° C'de xg 12000 az 15 dakika boyunca ortaya çıkan süpernatant Santrifüj
28. Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet buz homojenizasyon tampon tampon / g (ıslak ağırlık) hücreleri 6,5 ml.
29. 3000 xg'de 5 dakika santrifüj 4 ° C
30. 4 ° C'de xg 12000 az 15 dakika boyunca ortaya çıkan süpernatant Santrifüj
31. Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet buz SEM tampon 3 ml.

** Bu süspansiyon mitokondri zenginleştirilmiş olmasına rağmen, aynı zamanda (mikrozomları) endoplazmik retikulum, golgi ve vakuollerde gibi diğer organelleri içerir. Saf mitokondri almak için, bu ham mitokondrial fraksiyon aşağıda açıklandığı gibi, daha fazla fraksiyonasyon tabi olabilir .**

Kontaminasyon mitokondri yoksun diğer organellerin saflaştırılması

1. Beckman Ultra Clear santrifüj tüpü içine EM tamponunda% 60 buz koyun 1,5 ml sakkaroz (w / v).
2. Yerleşimi% 60 (w / v) 4 ml% 32 ile sakaroz, 1.5 ml% 23,% 15 sakaroz (EM wt / v tampon) 1,5 ml.
3. 3 ml,% 15 (w / v) sakaroz üst SEM tampon ham mitokondriyal fraksiyonu yerleştirin.
4. 4 134000 xg (33000 rpm) 1 saat ° C Beckman SW41 Ti sallanan kovalı rotor içinde Santrifüj
5. % 60 /% 32 sakaroz arayüzü sağlam mitokondri formu kahverengi bir bant.
6. Mitokondriyal bant ulaşana kadar dikkatlice sakaroz çıkarın.
7. Bir kesim ucu ile bir pipet kullanarak mitokondriyal bandı çıkarın ve bir MLS-5 rotor için bir Beckman santrifüj tüpü içine yerleştirin.
8. SEM tamponu ile tüp doldurun.
9. Pelet, 4, 30 dakika süreyle 10000 xg (31000 rpm) 'de 30 dakika süreyle bir MLS-5 rotor santrifüj saf mitokondri ° C
10. Kullanarak Durusu süpernatantbir pipetle.
11. Mitokondriyal fonksiyonları, mitokondriyal proteom ve lipidome ve mitokondriyal DNA analizi için saf mitokondri kullanın.

Reaktifler

1. DTT tampon [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol] (15 ml için)
   • 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 tampon (pH 9.4)
   • 1 M DTT 150 ul
   • 15 ml hacim
2. Zymolyase tampon [20 mM potasyum fosfat (pH 7.4), sorbitol 1,2 M] (100 ml)
   • 2 ml 1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.4)
   • Sorbitol 2 M 60 ml
   • 100 ml hacim
3. Homojenizasyon tampon [10 mM Tris / HCl (pH 7.4), 0.6 M sorbitol, 1 mM EDTA,% 0.2 (w / v) BSA] (250 ml.]
   • 1 M Tris / HCl tamponu (pH 7.4) 2.5 ml
   • Sorbitol 2 M 75 ml
   • 500 mM EDTA 500 ul
   • BSA 0.5 g
   • 250 ml hacim
4. SEM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7.2), 250 mM sukroz, 1 mM EDTA] (250 ml)
   • 1 M MOPS / KOH tamponu (pH 7.2) 2.5 ml
   • 31.25 ml 2 M sakkaroz
   • 500 mM EDTA 500 ul
   • 250 ml hacim
5. EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (250 ml)
   • 1 M MOPS / KOH tamponu (pH 7.2) 2.5 ml
   • 500 mM EDTA 500 ul
   • 250 ml hacim

Discussion

Bu yöntem, maya hücreleri saf mitokondri yüksek verimli izolasyon sağlar. Bu yöntemi ile saflaştırılmış Mitokondri kontaminasyon diğer organellerin aslında ücretsiz ve kendi arıtma sonrası yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korumak. Temel mitokondriyal süreçlerin hücre sulandırıldıktan için uygun olan mitokondri açıklanan yöntem verim. Bu son derece saf mitokondri mitokondriyal yapı ve işlevleri, mitokondriyal proteom ve lipidome ve mitokondriyal DNA analizi için de kullanılabilir.