Summary
هذا البروتوكول وصف العزلة والتوسع اللاحق في خلايا انسجة وخلايا اللحمة المتوسطة مستعمرة البطانية التي تشكل من دون استخدام الحيوان مصل لتوليد أزواج ذاتي لأغراض زراعة تجريبية.
Abstract
الحبل السري مصدرا غنيا للخلايا الاصلية مع إمكانات عالية التكاثري بما في ذلك الخلايا اللحمية الوسيطة (وتسمى أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة ، MSCS) والخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة السلف (ECFCs). كلا النوعين من الخلايا اللاعبين الرئيسيين في المحافظة على سلامة الأنسجة وربما تشارك أيضا في عمليات التجدد وتشكيل الأورام.
لدراسة البيولوجيا وظيفة بطريقة نسبية من المهم أن يكون كل أنواع الخلايا المتاحة من الجهات المانحة نفسها. قد يكون من المفيد أيضا لأغراض التجدد واللجان الدائمة لاستخلاص ECFCs من النسيج نفسه.
لأن العلاجات الخلوية وينبغي أن تجد طريقها من مقاعد البدلاء إلى جانب السرير أنشأنا طريقة جديدة لعزل وتوسيع الخلايا الاصلية من دون استخدام البروتين الحيواني. استبدال تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL) مصل بقري جنيني في جميع خطوات بروتوكول جهدنا لتجنب الاتصال تماما من الخلايا البروتينات لأعضاء غير بشرية.
هذا الفيديو يوضح منهجية لعزل وتوسيع الخلايا الاصلية من الحبل السري واحد.
وسيتم شرح جميع المواد والإجراءات.
Protocol
الجزء 1 : إعداد
1. إعداد مستنبت الخلية
قبل البدء في إعداد المتوسطة جمع كل المواد والأدوات التي سوف تحتاج إليها.
ذوبان الجليد 2 × 56 مل من aliquots lysate تجميع الصفائح الدموية البشرية (pHPL ، عصامي : مرجع 1 & # إن الرب 1523) ، و 10 مل من البنسلين 100X / حل الستربتوميسين ، 2 × 5 مل من L - الجلوتامين (سواء سيغما).
ذوبان الجليد في خلوى وaliquots عامل النمو (VEGF ، bFGF ، EGF ، IGF ، هيدروكورتيزون ، حمض الأسكوربيك ، الهيبارين ، على النحو المنصوص عليه الامفوتريسين 'quots واحدة') لاستكمال تعديل 1 زجاجة (500 مليلتر) من EGM - 2 المتوسط (Lonza).
من الثلاجة تأخذ زجاجة واحدة من كل 500 مل (ط) ألفا معدلة والوسيلة الأساسية الدنيا (أ - MEM) و (ب) متوسطة القاعدية البطانية (EBM).
يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في غطاء تدفق الصفحي زراعة الأنسجة تحت ظروف معقمة.
إعداد الهيبارين حافظة خالية (على سبيل المثال ، Biochrom) عن طريق تذويب المسحوق إلى تركيز النهائي من 1000 وحدة دولية / مل مع الماء المعقم.
MSC - المتوسطة :
استخدام 500 مل من MEM ، إضافة 56 مل من pHPL إذابة (أنظر المرجع أيضا 1 لمزيد من التفاصيل) وحدة دولية / 2 مل (= 224 ميكرولتر من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة (يجنب تجلط الدم من خلال تكتل المتوسطة والفيبرينوجين في البلازما) للوصول إلى التركيز النهائي للpHPL 10 ٪. بالإضافة إلى ذلك إضافة البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100μg/mL) من الحل و2mm وL - Glutamin (سواء سيغما).
تصفية المتوسطة من خلال 20 ميكرون ، حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ).
ECFC المتوسطة :
استخدام زجاجة واحدة (500 مليلتر) من EBM ، إضافة aliquots خلوى ، 56 مل من pHPL ، 10 وحدة دولية / مل (= 1120μl من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة ، البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100 غرام / مل) من الحل و2mm وL - Glutamin إلى القاعدية والمتوسطة مع فلتر - 20 ميكرولتر حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ).
2. تعقيم الأدوات الجراحية
يجب ملقط ، زوج من مقص حاد حامل مشرط الجراحة وتكون الحرارة المستهلكات خام تعقيم عقيمة.
3. إعداد أنابيب لجمع الحبل
إضافة 500 وحدة دولية من المواد الحافظة -- الهيبارين مجانا إلى 50 مل أنابيب البولي بروبلين (فالكون) ، والتكيف مع الحجم النهائي من 20 مل مع برنامج تلفزيوني. أنابيب نقل إلى غرفة الولادة.
4. الموافقة المستنيرة (أكد من قبل لجنة أخلاقية الخاص المحلي أو IRB).
نطلب من الآباء والأمهات قبل الولادة إذا كانت ترغب في التبرع بقطعة من الحبل ، وإبلاغ كافية لهم لأغراض أنه سيخدم.
5. الحبل التبرع
بعد خفض التسليم والتفتيش على المشيمة والحبل السري خارج قطعة 10 سم ونقل على الفور إلى أنبوب الخاص المعبأة مسبقا مع الهيبارين لتجنب تجلط الدم داخل الأوعية المتبقية الحبل. على تواصل مع عزل الخلايا في أقرب وقت ممكن.
الجزء 2 : عزل الخلايا
- إعداد الصفحي زراعة الأنسجة هود التدفق عن طريق تنظيف الأسطح مع Incidin أو 70 ٪ EtOH. مكان معقم 150 سم ثقافة الخلية 2 لوحات ، و 75 قارورة سم ثقافة خلية (سواء كورننغ) ، برنامج تلفزيوني ، تعقيم الأدوات الجراحية ومكاشط الخلية ، حامل أنبوب ، 25 stripettes مل و 5 مل حقن الإبر مجهزة بشكل مناسب في نهاية حادة الغطاء الخاص تنظيفها.
- قبل الدافئة الخاص أعدت α - MEM - 2 وغير العادية مستنبت الخلية الى 37 درجة. مئوية في حمام مائي
- جلب سلك من غرفة الولادة إلى مختبر مجهز الخاص الخلية هود الثقافة. بعد تحويل الحبل الى تدفق الصفحي غسله مرتين في برنامج تلفزيوني (عن طريق نقل لوحة جديدة) للتخلص من خلايا الدم الملوثة. شطف الوريد السري بعد canulating على جانب واحد مع حقنة معقمة 5mL مجهزة إبرة حادة مع نهاية PBS حتى السوائل التي تخرج في الطرف الآخر من الحبل يصبح شفافا تماما (المحمر يشير إلى تلوث الدم).
ECFCs :
- إعداد 75 سم 2 قارورة (كورنينج) ، وتسميته في ملء 15-20 مل من المتوسط EGM - 2 قبل تحسنت.
- وضع الحبل في لوحة جديدة مليئة برنامج تلفزيوني العقيمة.
تأخذ المقص الجراحي وقطع الحبل السري في قطعتين من حوالي 5 سم في الطول (قطعة قصيرة يسهل عملية ، لأن السفن السري الملتوية على طول محور الخاصة بهم). - في محاولة للعثور على الوريد السري (سفينة كبيرة) ، تضاف شفرة واحدة من مقص الخاص الجراحية وخفض الوريد طوليا. عند هذه النقطة يمكن أن تكون مفيدة إذا كان يمكن أن تعقد مساعد السياق قطعت بالفعل مع اثنين بينما كنت ملقط قطع أخرى.
- وضع الحبل الدائريم مع قطع الوريد في لوحة جديدة من دون برنامج تلفزيوني ، واتخاذ مكشطة الخلية وكشط السطح (البطانية) الداخلية للالوريد السري من قبل rubbings واحدة من نهاية إلى أخرى. نقل الخلايا إلى قارورة الخاص الذي أعدته تنظيف غيض من مكشطة في المتوسط. كرر هذا الإجراء لا يقل عن 10 مرة.
- إغلاق القارورة الخاص ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ من الرطوبة).
اللجان الدائمة :
- تعد لوحة 150 سم ثقافة 2 (كورنينج) وتسميته.
- تأخذ قطعة من الحبل (بعد تجريف قبالة الطبقة البطانية) ، وقطع الحبل كله الى قطع صغيرة جدا باستخدام مقص العقيمة ومشرط معقم. وينبغي أن الحد الأقصى لحجم قطع الحبل السري يمكن 1-2 ملم.
- نقل قطع الحبل السري الخاص بك مع ملقط معقم في صحنك ثقافة ما قبل المسمى. قبل مغادرته لوحة مفتوحة لمدة 5 دقائق قبل ملء مع المتوسط ، ويتعزز المرفق من القطع البلاستيكية على السطح.
- حالما يتم توصيل القطع بشكل مناسب لسلك من البلاستيك ، إضافة برفق في 30-35 مل من قبل تحسنت ألفا معدلة MEM. محاولة استخدام أدنى سرعة للتأكد من أن جميع القطع لا تزال تعلق.
- إغلاق لوحة ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ من الرطوبة).
الجزء 3 : توسيع الخلايا وتأكيد النمط الظاهري المناعة بواسطة التدفق الخلوي
توسيع الخلية
EFCFs :
- تحقق من مرفق من الخلايا البطانية في اليوم التالي على مجهر مقلوب وتبادل كله EGM - 2 المتوسط للتخلص من كافة الخلايا غير المرفقة والجسيمات.
- توسيع الخلايا حتى ثلث التقاء وتبادل المتوسط مرتين في الأسبوع. عندما يتم التوصل إلى نقطة التقاء ، فصل الخلايا مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA ونقلها إلى السفن ثقافة جديدة. اعتمادا على عدد من الخلايا داخل القارورة T75 الخاص بك ، يجب عليك اختيار حجم وعدد من القوارير الجديدة الخاصة بك لضمان انخفاض كثافة البذر لمزيد من التوسع.
- تبادل ثلث المتوسط مرتين في الأسبوع خلال التوسع في الخلايا.
اللجان الدائمة :
- وثمرة من اللجان الدائمة من الحبل يستغرق مزيدا من الوقت ، حتى تتمكن من الانتظار على الأقل 3-4 أيام حتى تقوم بالتدقيق على مجهر مقلوب لظهور خلايا مغزلية الشكل في محيط القطع الأنسجة المرفقة. عندما يكون هناك ما يكفي من الخلايا من النمو ، ويميلون إلى فصل القطع لأنها تفقد الاتصال مع البلاستيك.
- بعد 10-12 يوما إزالة قطع الأنسجة ، وفصل اللجان الدائمة من البلاستيك مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA ونقلها إلى السفن ثقافة جديدة. اعتمادا على كمية من الخلايا داخل صحنك يجب عليك أن تقرر حجم وعدد من القوارير الجديدة الخاصة بك لضمان انخفاض كثافة البذر لمزيد من التوسع.
- تبادل ثلث المتوسط مرتين في الأسبوع خلال التوسع في الخلايا.
التدفق الخلوي
المعدات اللازمة :
تدفق عداد الكريات دينار بحريني (FACSCalibur) ، ميكرونية أنابيب (كورنينج) ، حامل الأنبوب والأغنام المصل (حظر كاشف) ، Eppifuge (إيبندورف) ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة
اللجان الدائمة : CD45 ، CD14 ، CD19 ، HLA - DR ، CD31 ، CD73 ، CD90 ، CD105 ، والضوابط isotype
ECFCs : CD45 ، CD14 ، CD19 ، HLA - DR ، CD31 ، CD34 ، CD90 ، CD105 ، CD144 ، CD146 ، والضوابط isotype
- بعد التوصل إلى نقطة التقاء ، فصل الخلية مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA والطرد المركزي في 300g لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلايا إلى تركيز خلايا 1x10 6 / مل في برنامج تلفزيوني وتعديل كتلة ملزمة الأضداد غير محددة ب 10 ٪ V / V مصل الأغنام لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تسمية أنابيب ميكرونية وإضافة المناسب للتركيز الأجسام المضادة المسماة الفلورسنت.
- إضافة تعليق ميكرولتر من 50 خلية (المحظورة) لكل أنبوب ، واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- غسل خلايا معدلة بإضافة برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة غير ملزم.
- تذهب مع الخلية المسمى الخاص إلى تدفق عداد الكريات وتنفيذ التحليل.
الجزء 4 : مستعمرة ECFC النمو والتثبيت ، وتلطيخ وتحليل التسلسل الهرمي
- البذور وحصاد ECFCs نقية تقريبا في كثافة منخفضة جدا من الطلاء 3 أو 10 خلايا لكل سنتيمتر مربع في لوحات ثقافة خلية للسماح للنمو مستعمرة واحدة.
- تبادل ثلث المتوسط مرتين في الأسبوع.
- بعد 14 يوما (نهاية الثقافة) إزالة المتوسطة ، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح المستعمرات مع الحل التثبيت الجليد الباردة (الأسيتون : الميثانول = 3 : 2) لمدة 15 دقيقة في الثلاجة.
- تجاهل الحل التثبيت وترك لوحات مفتوحة حتى يجف لمدة 10 دقيقة.
- ترطيب الخلايا مع الماء المقطر لمدة 10 دقيقة.
- إضافة هاريس الهيماتوكسيلين الحل وصمة عار للمستعمرات ثابتة لمدة 12 دقيقة.
- إزالة H matoxylin حل لوحات وشطف مع مياه الصنبور للتخلص من الحل تلطيخ المتبقية.
- التقاط الصور من كل مستعمرة من قبلاستخدام واستيراد stereomicroscope *. jpg أو *. TIF شكل ملفات على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
- فتح الصور مع برنامج ImageJ وتحليل دقيق لعدد الخلايا في كل مستعمرة كما هو موضح في الرسوم المتحركة.
- افتح البرنامج واستيراد ImageJ صورة مستعمرة باستخدام "ملف \ فتح' وظيفة في سحب أسفل القائمة.
- المضي قدما باستخدام "عملية \ طرح الخلفية' الدالة
- استخدام وظيفة "الاختيار * * بيضاوي الشكل أو فرشاة' في القائمة ImageJ بمناسبة هامش مستعمرة.
- صورة واضحة المحيطة به "تعديل \ مسح خارج' وظيفة واقتصاص الصورة عن طريق تحديد "صورة \ المحاصيل.
- ضبط عتبة يدويا باستخدام "صورة \ ضبط \ عتبة' الدالة ، بحيث يتم تماما كافة الخلايا الملونة باللون الأحمر.
- حساب عدد الخلايا من مستعمرة عن طريق تحديد "تحليل \ تحليل الجزيئات. اختيار الإعدادات المناسبة (الأمثل لكل نوع من الخلايا) وحدد "موافق". سوف مربع النتائج ، بما في ذلك عدد الخلايا وصورة جديدة تحتوي على الخطوط العريضة المماثلة من الخلايا تظهر عدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك مجموعة متنوعة من المصادر التي تحصل على اللجان الدائمة أو ECFCs بما نخاع العظام ، والأنسجة الدهنية ، دم الحبل السري ، الخ.
فمن الضروري الحصول على كلا النوعين من الأسلاف من المصدر نفسه للمقارنة مباشرة إشراك أنواع مختلفة من الخلايا في عمليات مثل الأنسجة وتجديد السفن أو المساهمة في تطور الورم.
السهولة التي لعزل ودراسة أزواج في وقت لاحق من ECFCs ذاتي واللجان الدائمة من الجهة المانحة نفسها يجعل هذه الطريقة مفيدة لاستبعاد الاختلافات المانحة ضمن التجارب الفردية.
يتم التقليل من تلوث محتمل مع الخلايا المكونة للدم من خلال خطوة الركض وأكد مع التدفق الخلوي.
إذا فعلت بشكل صحيح ، يجب أن الخلايا المعزولة (ط) ميزات حصة الخلايا الاصلية ، (ب) تكون متاحة للزراعة التجريبية بكميات كافية و (ج) تكون نقية كما أكده التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم أي تضارب في المصالح المالية أن تعلن.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر كاتارينا Schallmoser لتوفير pHPL ، إيفا ورود هوفمان نيكول للتعليقات مفيدة للمخطوطة ، ومارغريتا دانييلا ثالر hwirth الأب للحصول على المساعدة التقنية ، ومونيكا لتحرير فاريل لغوية ، لانج أوفه ، Holzapfel مارجيت وساندرا Eppich في قسم التوليد لتوفير الحبال.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث النمساوية (FWF ، منح N211 - NAN إلى DS) ، لتعزيز البحوث النمساوية وكالة (FFG ، ومنحة لN200 DS) والخلايا الجذعية للبالغين ومؤسسة أبحاث (ع). AR وزميل في الطب الجزيئي برنامج الدكتوراه من كلية الطب بجامعة غراتس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha modified MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-GLutamin | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | ||
| EBM | Lonza Inc. | ||
| Single cytokine quots | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 flasks | Corning | ||
| 150 cm2 plates | Corning | ||
| Cell scraper | Corning | ||
| Trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Monoclonal antibodies | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| 50 ml tubes | Falcon BD | ||
| 500 mL filter 20 μm pore size | EMD Millipore | ||
| Preservative free heparin | Biochrom AG |
References
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
