Summary
Методология, чтобы изолировать высокой молекулярной массой и высокой геномной ДНК качества из почвы микробного сообщества описывается.
Abstract
Почвы микробиомом является обширной и относительно неисследованными резервуар геномного разнообразия и метаболических инноваций, которые тесно связаны с питательных веществ и поток энергии в наземных экосистемах. Выращивание-независимой экологической геномной, также известный как метагеномных, подходы обещания беспрецедентный доступ к этой генетической информации в отношении реконструкции пути и функциональные обследования на высокую терапевтическую ценность и процессов конверсии биомассы. Тем не менее, почва микробиомом все еще остается проблемой в значительной степени из-за трудностей в получении высокого молекулярного веса ДНК достаточного качества для крупносерийного производства библиотеке вставки. Здесь мы вводим протокол для извлечения высокой молекулярной массой, микробного сообщества геномной ДНК из почв и донных отложений. Качество изолированной геномной ДНК идеально подходит для создания больших вставить экологические геномных библиотек для последующих применений последовательности и скрининга.
Процедура начинается с лизиса клеток. Клеточные стенки и мембран микробов лизируются как механическое (измельчение) и химической силы (β-меркаптоэтанол). Геномная ДНК затем выделяли с использованием буфера для экстракции, хлороформ-изоамиловый спирт и изопропиловый спирт. Буферы используются для лизиса и добычи шаги включают в себя изотиоцианата гуанидина и hexadecyltrimethylammonium бромида (СТАВ), чтобы сохранить целостность высоким молекулярным весом геномной ДНК. В зависимости от вашего вниз по течению приложений, изолированных геномной ДНК может быть дополнительно очищают, используя хлорид цезия (CsCl) градиент ультрацентрифугирования, что снижает примесей в том числе гуминовых кислот. Первая процедура, добыча, занимает около 8 часов, за исключением ДНК шагом количественной оценке. CsCl ультрацентрифугирования градиент, является два дня процесса. Во время всей процедуры, геномной ДНК, следует относиться осторожно, чтобы предотвратить стрижки, избегайте тяжелой вортексе, и повторяющиеся суровые пипетки.
Protocol
Часть I: Добыча ДНК
Процедура
1. 8 часов не требуется, для обработки 6 образцов, исключая количественную ДНК.
Прежде чем приступить к добыче, вам необходимо предварительно холод раствор, пестик и шпатель в морозильной камере -20 ° C или с использованием жидкого азота. Кроме того, предварительное охлаждение 50 мл пробирки с 20 мл хлороформа изоамиловый спирт (24:1) на льду. Установить гибридизации духовку до 65 ° С для предварительного нагрева. Проверьте ЦТАБ решение, если оно кристаллизуется теплый до 60 ° С, чтобы расплавить кристаллы. Полное денатурации раствора и извлечения буфер добавлением последних ингредиентов только перед началом добычи (см. рецепт ниже). Поведение всех добычи процедур в вытяжном шкафу.
2. Подготовка денатурирующих буфера и буфера для экстракции.
Примечание: Для обеспечения максимального выхода ДНК, очень важно, чтобы точно сделать буферов и следуйте инструкциям.
3. Помещают 2 г почвы в предварительно охлажденной ступке.
Обратите внимание: обработка почвы, собранных в полевых условиях должны быть заморожены на сухом льду для транспорта и хранили при -80 ° C. Оттепель и сито почвы использованием 2 мм сито до выделения ДНК. Вы можете увеличить, начиная количество почвы до 10 г.
4. Добавить 1 мл денатурирующих решение почвы.
5. Замораживание и молоть почву в жидком N 2, с помощью пестика до частицы почвы выглядят порошкообразных и однородной. Повторите замораживание и измельчение в два раза.
Примечание: Следует образца почвы замороженные во время шлифовки, использует достаточное количество жидкого азота, чтобы полностью покрыть образца почвы. Незначительные плавления при шлифовальных является приемлемым.
6. Передача земли почвы 50 мл коническую трубку с помощью предварительно охлажденным шпателем.
Примечание: образец почвы земли могут храниться при температуре -80 ° С на данный момент, если это необходимо.
7. Добавить 9 мл экстракционного буфера. Для смешивания раствора и почвы, вихревые кратко на низкой скорости.
Примечание: Для обеспечения буфера однородна, тепло при температуре 60 ° С в течение 10-15 минут перед использованием. Держите остальную часть буфера при 60 ° С в течение добычи. Vortex на скорости 8 (по шкале, где 10 является максимальным).
8. Инкубируйте в течение 40 мин при 65 ° С в гибридизации духовке. Во время инкубации, постоянно вращаются трубы на минимальной скорости, или аккуратно переверните трубы через каждые 10 мин.
Примечание: Поместите пробирку горизонтально в гибридизации духовку, чтобы связаться с буфером почвы на большой площади поверхности. Решение может выглядеть немного вязкой во время инкубации.
9. Центрифуга при 1800 х г, в течение 10 минут при температуре 10 - 14 ° C. Передача супернатант в предварительно охлажденные 50 мл коническую трубку, содержащую 20 мл хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), держать на льду.
Примечание: При передаче супернатант, будьте осторожны, чтобы не нарушить органический слой (нижний слой). Оставьте 1-2 мл надосадочной, если это необходимо для того, чтобы собирать только чистую супернатант. Вы часто можете видеть бежевый слой (примерно 1-3 мм в толщину) в верхней части супернатант. Не беспокоить этот слой при сборе супернатант. Попробуйте скользить кончиком вдоль стенки трубы, чтобы предотвратить поломку этого бежевый слой. Если супернатант слишком мутная, повторите хлороформ-изоамиловый спиртовой экстракции еще один раз на супернатант. Не следует использовать одноразовые пластиковые пипетки при передаче хлороформ, как хлороформ будет плавиться пластмасса. Используйте стеклянную пипетку, или стакан мерный цилиндр, или залить хлороформ непосредственно в 50 мл конические пробирки.
10. Извлечение почву гранул 2 раза;
10.1. Добавьте 5 мл буфера для экстракции в почву гранул, хорошо смешайте с использованием 1 мл кончик их краткое вортексе на низкой скорости.
Примечание: встряхните и перемешайте буфер перед использованием.
10.2. Инкубировать при 65 ° С в течение 10 мин при гибридизации духовке. Центрифуга при 1800 х г, в течение 10 минут при температуре 10 - 14 ° C.
Передача супернатант к трубе на шаге 9. Держите трубку с собранной супернатант и хлороформ-изоамиловый спирт на льду во время добычи.
Примечание: Убедитесь, что вы добавляете супернатант к тому же трубы без креста смешивание между образцами.
10.3. Повторите 9.1 и 9.2 еще раз.
11. Использование вращающихся пластин, очень мягко рок трубка, которая содержит собранные супернатант (14-19 мл) и хлороформ-изоамиловый спирт на 1,25 оборотов в минуту в течение 10 мин.
Примечание: Закройте крышку очень плотно, чтобы предотвратить утечку. Положите бумагу полотенце на качалке пластины, прежде чем разместить трубки так что любая утечка может быть легко обнаружен.
12. Центрифуга при 1800 х г, в течение 20 минут при температуре 10 - 14 ° C.
13. Передача водной фазы в новую пробирку.
Примечание: Не беспокоить интерфазе между водной фазы (верхний слой) и органический слой (нижнийслой) при передаче супернатант. Оставьте около 1.5-2 мл надосадочной обеспечить сбор только чистого супернатант.
14. Восстановление ДНК с использованием изопропилового спирта (шаг 15.a - 21.a). Вместо этого можно использовать Amicon ® Ultra-15 центробежный фильтр устройства (шаг 15 b - 21.b), если вы ожидаете очень низкий объем биомассы в вашей выборке, которая будет производить почти не видно пули в изопропиловый спирт осадков, которые трудно восстановить.
15.a. Место супернатант в новую ультрацентрифуге трубки.
16.a. Добавить изопропиловый спирт для собрано супернатант в объемном соотношении 0,6:1. Обратить трубы аккуратно несколько раз перемешать.
17.a Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.
18.a. Центрифуга на 16000 х г, в течение 20 мин при температуре 20 - 25 ° C. Обеспечить весов всех трубы сбалансированные задолго до центрифугирования шаг.
Примечание: Марк направлении центробежной силы на трубе, так что вы можете обнаружить ДНК гранулы легче, когда ДНК доходность низкая.
19.a. Удалить изопропилового спирта декантацией или вакуумной аспирации. Будьте осторожны, чтобы не нарушать ДНК гранул.
Примечание: Снимите изопропиловый спирт, как только центрифугирования завершена. Будьте очень осторожны, чтобы не потерять ДНК гранул. Размер гранул ДНК может широко варьировать в зависимости от типа почвы, от четко видны (~ 9 мм в диаметре) с едва заметным. Рекомендуется, чтобы удалить остатки изопропилового спирта путем отсасывания вдоль стенки трубки осторожно, чтобы не всасывания из ДНК гранул.
20.a. Сухие гранулы ДНК при комнатной температуре в течение 5 - 20 мин.
Примечание: Не более сухих гранул ДНК, в противном случае трудно будет растворяться ДНК.
21.a. Ресуспендируют ДНК осадок в 200 мкл ТЕ. Смешайте это, осторожно коснувшись. Передача ДНК раствора в 1,5 мл трубки. Держите трубку при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы полностью растворить ДНК.
Примечание: В зависимости от размера гранул, вы можете регулировать громкость ТЕ добавить. Обычно 200 - 400 мкл ТЕ работает хорошо.
* Кроме следуйте 15.b - 21.b.
15.b. Предварительная стирка Amicon ® Ultra-15 центробежный фильтр устройства, добавить 15 мл TE к устройству и центрифуге при 3500 х г, в течение 10 мин. Отменить проточные.
16.b. Место раствора ДНК с шагом от 13 до предварительно мыть Amicon фильтр. Центрифуга при 3500 х г до ДНК объем уменьшается до 200 - 500 мкл. Отменить проточные.
17.b. Вымойте ДНК с TE в два раза, добавить 10 мл TE к Amicon фильтр устройства. Центрифуга при 3500 х г до ДНК объем уменьшается примерно до 200 мкл. Отменить проточные. Повторите еще раз.
18.b. Передача ДНК решение на фильтр для нового 1,5 мл трубки.
19.b. Добавить 40 мкл ТЕ к фильтру Amicon. Вымойте обе стороны мембраны фильтра с помощью пипетки вверх и вниз для того, чтобы восстановить любой ДНК остаток на фильтре. Добавить промывочного раствора в пробирку с шага 18.b.
20.b. Если необходимо, ДНК может быть дополнительно концентрируют микроконтроллер ® Ultracel YM-30 центробежный фильтр блока; предварительной стирки фильтра путем добавления 200 мкл ТЕ-и центрифугирования при 10000 х г в течение 7 минут. Добавить раствора ДНК к фильтру и центрифуге при 5000 х г в течение 1 мин. Повторите центрифугирования, пока количество раствора ДНК на фильтре снижается до 50 мкл приблизительно.
Примечание: Максимальный начальный объем выборки для микроконтроллер фильтром составляет 500 мкл. Не центрифуга со скоростью более 14000 х g. Не более центрифуги, пока мембрана высыхает полностью. Убедитесь, что некоторые жидкости все еще покрывает фильтра после центрифугирования. Если вы в течение центрифугировали и мембраны сухой, затем добавить 15 мкл ТЕ, агитировать мягко в течение 30 секунд, и переходите к шагу 21.b.
21.b. Место фильтра вниз головой в новую пробирку и микроконтроллер центрифуге при 1000 мкг в течение 3 минут для восстановления ДНК.
22. Количественная ДНК TAE геля (0,8%, 0.5xTAE, 50 В в течение 4 часов), а также Nanodrop спектрофотометр или Pico-зеленый анализа и ридер.
Примечание: количество ДНК может быть оценена путем сравнения образцов группу, чтобы маркер полосы с известной концентрацией (Высокий молекулярный маркер ДНК или λHindIII) на геле.
23. Проверьте целостность высокой молекулярной ДНК вес с помощью импульсного гель-электрофореза поле (PFGE) с 1%, 1xTAE гель (подробнее см. Шаг II, часть 2 на https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , DOI: 10.3791/1387 по Taupp и др. 2009)..
Примечание: Вы можете использовать регулярные агарозном геле для этой цели контроля качества, а не низкой температурой плавления агарозы. Короче говоря, электрофорез условия следующие: 2-250 Кб, 6 вольт, начальное время переключения: 5 сек, окончательное время переключения: 15 сек, запустить в течение 12 часов при 14 ° C. SYBR Золотой окрашивания в течение одного часа для визуализации ДНК на геле.
24. Если молекулярный вес добытых ДНК являются удовлетворительными, то переходим к следующему шагу CsCl центрифуги градиента. Кроме того, ДНК можно хранить при температуре -20 ° С или -80 ° С до CsCl центрифуги.
Средний размер ДНК должна быть равна или превышает 36 Кб, если вы хотите построить большие вставки метагеномных ДНК библиотеки.
Часть II. ДНК очистки с использованием цезия ультрацентрифугирования градиент хлорида
Подготовка центрифуги: 1,5 - 2 часа
Центрифугирование шаг: 18 часов
Удаление этидия бромид (EtBr) и концентрации ДНК после центрифугирования: 3 часа
Процедура
Подробнее см. Райт и др.. . 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , DOI: 10.3791/1352
Представитель Результаты / Результаты
Общая сумма геномной ДНК, выделенной из 2 г лесной почвы органическими (О горизонта) и минеральных горизонтах (Ае, А. Б., и Bt горизонты) (отобранных из долгосрочного плодородия почв (LTSP) сайта, расположенного на Skulow озера, Британская Колумбия, Канада и управляется до н.э. Министерства лесного хозяйства и Range) колебалась от 10 мг до 180 мг. Средний размер выделенной ДНК, как правило, от 40 - 60 кб (рис. 1). Отношение поглощения при 260 нм nm/280 между 1.3-1.6 и был пик при 230 нм, что может свидетельствовать гуминовые кислоты загрязнения часто наблюдается в образцах почвы. Центрифугирования в градиенте CsCl резко сократилось этого загрязнения, а также увеличение соотношения 260/280 до 1,8 - 1,9, как показано на рис 2а и 2б.
Рисунок 1. PFGE фотографии извлеченных геномной ДНК до CsCl ультрацентрифугирования. lane1: 1 кб маркера 100 нг, переулок 2: λHind III маркера 100 нг, переулок 3: λHind III маркера 250 нг, переулок 4: λHind III маркера 500 нг, lane5: Fosmid 36 кб маркера 100 нг, переулок, 6 и 7: геномной ДНК, выделенная из минеральной почве горизонта Ае, переулок 8 и 9: геномной ДНК, выделенной из горизонта АВ почвы минеральными на сайте LTSP расположен Skulow озера, BC
Рисунок 2. Chromograms геномной ДНК обнаружены спектрофотометр до (А) и после CsCl ультрацентрифугирования (B). Обратите внимание на сокращение значение абсорбции при длине волны 230 нм после CsCl ультрацентрифугирования, что указывает на улучшение качества геномной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития, Геном Британской Колумбии и Британской Колумбии Министерства лесного хозяйства и диапазон для поддержки текущих исследований продуктивности лесов почвы. SL была поддержана общение с ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
