Biology

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Abstract

Een stamcel is gedefinieerd als een cel met de capaciteit om zowel de zelf-vernieuwing en het genereren van meerdere gedifferentieerde nageslacht. Embryonale stamcellen (ESC) zijn afgeleid van de blastocyst van de vroege embryo en zijn pluripotent in differentiative vermogen. Hun ruime differentiative potentieel heeft hen de focus van veel onderzoek gericht op het afleiden hoe ze te coax te klinisch bruikbare soorten cellen te genereren. De succesvolle afleiding van hematopoietische stamcellen (HSC) van muis ESC is onlangs bereikt en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol. HSC, misschien wel de klinisch meest uitgebuite cel populatie, worden gebruikt om een groot aantal hematopoietische maligniteiten en aandoeningen te behandelen. Echter, veel patiënten die baat kan hebben bij HSC therapie geen toegang tot geschikte donoren. ESC zou kunnen bieden een alternatieve bron van HSC voor deze patiënten. Het volgende protocol voorziet in een basislijn vanwaar ESC-HSC kan worden bestudeerd en op de hoogte inspanningen om HSC isoleren van menselijke ESC. In dit protocol worden ESC gedifferentieerd embryoid instanties (EBS) voor 6 dagen in de handel verkrijgbare serum vooraf gescreend voor een optimale hematopoietische differentiatie. EBS worden vervolgens gescheiden en geïnfecteerd met retrovirale HoxB4. Geïnfecteerde EB-afgeleide cellen worden uitgeplaat op OP9 stroma, een beenmerg stromale cellijn afgeleid van de Calvaria van M-CSF-/ - muizen, en co-gekweekt in de aanwezigheid van hematopoiese het bevorderen van cytokines voor tien dagen. Tijdens deze co-cultuur, de geïnfecteerde cellen sterk uit te breiden, wat resulteert in de generatie van een heterogene pool van 100s van miljoenen cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om de reddings-en reconstitueren dodelijk bestraalde muizen.

Protocol

Differentiatie van embryonale stamcellen

Verzamel een bijna samenvloeiing fles van embryonale stamcellen (ESC) via een behandeling met trypsine ESC.
Resuspendeer cellen in 5 ml Differentiatie media en over te dragen aan een niet-gelatine gecoate T25. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Ophalen supernatant en het verzamelen van cellen via centrifugeren.

Let op: muis embryonale fibroblasten (MEF) van het ESC culturen hechten gemakkelijk aan de niet-gelatine gecoate T25 en dus zijn uitgeput van de cultuur tijdens deze plating stap. Als je niet kweken uw ESC op MEFs, gaat u naar de pre-plaat.
Resuspendeer MEF-uitgeput ESC in Differentiatie media op 333.333 cells/50 mL. Deze concentratie resulteert in een 100 ml ESC/15.
Gebruik van multi-channel pipet, plaat ESC op 100 cells/15 mL druppel op 15 cm ² petri platen. Met een 8-kanaals pipet, moet u in staat om te passen over 18 tot 22 rijen van druppels per plaat (ongeveer 5 ml per plaat).

Let op: Voor dit protocol, 2-5 15 cm ² schotels van druppels is meer dan voldoende moet opleveren 2-5 x 10 ⁶ dagen zes EB-afgeleide cellen.
Voorzichtig flip platen aan druppels keren. Incubeer bij 37 ° C 5% CO ₂ voor 48 uur.
Pool valt onder voorzichtig schudden platen en over te dragen aan 15 ml conische buis. Spoel borden met 4-6 ml PBS en toe te voegen aan dezelfde 15 ml conische.

Opmerking: U kan zich ophopen tot vijf opknoping laten vallen platen. De EBS zal groeien als ze blijven om te differentiëren en als ze te geconcentreerd ze de neiging om grote pollen te vormen.
Laat gebundeld EBS om zich te vestigen door de zwaartekracht (ongeveer 10 minuten). Aspireren bovenstaande vloeistof zonder storende EBS. Zachtjes hersuspenderen in 10 ml Differentiatie media en transfer naar 10 cm niet-klevende petri plaat.
Plaats petri plaat op plaat shaker bij 50 rpm en incubeer bij 37 ° C 5% CO _2.
24 uur later (dag vier van differentiatie), te wervelen platen concentreren EBS in het centrum van de petrischaal. Zorgvuldig uitwisseling 50% van de media (5 ml) met 5 ml verse Differentiatie Media. Keer terug plaat aan incubator voor twee dagen.

EB dissociatie en infectie met MSCV-HoxB4-IRES-GFP

Op dag zes van differentiatie, transfer EBS tot 15 ml conische buis. Laat bezinken door de zwaartekracht.
Aspireren media en resuspendeer in 10 ml PBS. Laat EBS te vestigen door de zwaartekracht. Aspireren PBS.
Voeg 250 ml dissociatie enzym mix en 1 ml PBS. Incubeer in 37 ° C waterbad gedurende 20 minuten, soms wervelende metro naar enzymen en EBS mix.
Voeg 8 mL enzym vrij van dissociatie buffer.
Vermaal mengsel met 5 ml pipet tot de EBS zijn volledig gedissocieerd (ongeveer 10 keer; overmatige pipetteren de dood zal toenemen binnen de EB-afgeleide cellen voorbereiding).
1. Mengsel zal troebel met cellen als EBS dissociëren.
2. Het plaatsen van pipetpunt tegen onderkant van conische buis tijdens tritureren zal leiden tot een dwarskracht die sterk zal vergemakkelijken dissociatie.
Verzamel cellen via centrifugeren.
Resuspendeer EB-afgeleide cellen in 5 ml 10% IMDM en tellen met behulp van trypan blauw uitsluiting

Let op: Tussen dag vier en zes dagen van differentiatie, EBS caviteren wat resulteert in een grote hoeveelheid van apoptose en cel death.Thus, op dag zes, ruim 30% van de EB-afgeleide cellen kan kleuren met trypan blauw.
Resuspendeer EB-afgeleide cellen bij 100.000 cellen / 2 ml van 10% IMDM + virale supernatant zodanig dat een MOI van 5-10 is achieved.Add protaminesulfaat tot een uiteindelijke concentratie van 8 mg / ml.

Let op: Bereid genoeg EB / virale supernatant mix tot op het bord vier 6-well platen (uitgaande van 2 ml / putje).
Plaat 2 ml EB / virale supernatant mix per putje van vier 6 well platen vooraf bedekt met een OP9 stroma cellen (zie hieronder).
Centrifugeer platen bij 2500 rpm bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Overdracht platen om incubator bij 37 ° C 5% CO _2.
4-6 uur later, oogst supernatans van platen en het verzamelen van alle mogelijke cellen die overblijven in suspensie via centrifugeren.
Resuspendeer pellet (mag dan klein zijn) in 48 ml 10% IMDM + cytokines. Doseer 2 ml / putje van resuspentie naar de oorspronkelijke vier 6-well platen waarin de infectie was uitgevoerd en supernatant werd verzameld.

Let op: altijd voor te bereiden 10% IMDM + cytokines fris op het moment van gebruik.
Incubeer de platen bij 37 ° C 5% CO ₂ gedurende zeven dagen. Kolonies moet duidelijk zijn per dag vier na de besmetting en de grote en goed gevormd door zeven dagen. Een robuuste expansie moet opleveren 40-60 kolonies / goed op dag zeven.
Op dag zeven na infectie, verzamelen en zwembad alle cellen (inclusief OP9 stroma) van alle putjes door behandeling met trypsine.

Let op: NIET supernatant of PBS wast in dienst was tijdens trypsine treatment.At dit punt in de cultuur te verwijderen, kunnen sommige kolonies slechts losjes hechtend en er zijn veel cellen dobber voor deTing in suspension.Collect en het zwembad al wast en supernatant om ervoor te zorgen dat er geen potentieel waardevolle cellen worden verwijderd.
Resuspendeer cellen in 8 ml vers 10% IMDM + cytokines. Verdeel 2 ml / fles in vier T75 flessen. Voeg een extra 13 ml 10% IMDM + cytokines aan elke kolf. Incubeer bij 37 ° C 5% CO ₂ voor drie dagen (een totaal van tien dagen na besmetting).

Cultuur en plating van OP9 stroma

Onderhouden OP9 stroma volgens standaard protocollen in 20% a-MEM. OP9 cellen zullen de eigenschappen wanneer uitgegroeid tot confluentie. Altijd splitsen bij 80% confluentie op niet meer dan 1:3 splitsen.
24 uur voorafgaand aan de infectie van dag zes EB-afgeleide cellen met MSCV-HoxB4-IRES-GFP, plaat 25.000 OP9 cellen / putje van vier 6-well platen in 20% a-MEM.

Verzamelen, fractionering en transplantatie

Verzamel cellen uitgebreid op OP9 stroma tien dagen via een behandeling met trypsine. Tellen cellen.

Let op: Gooi supernatans of PBS wast in dienst tijdens de trypsine behandeling. Op dit punt in de cultuur, kunnen sommige kolonies slechts losjes hechtend en er zijn veel cellen drijven in suspension.Collect en het zwembad al wast en supernatant om ervoor te zorgen dat er geen potentieel waardevolle cellen worden verwijderd.

Opmerking: Een goede uitbreiding moet opleveren tussen 40-50 x 10 ⁶ cellen / originele software heeft 6-wells plaat, voor een totaal van 160 tot 200 x 10 ⁶ cellen.
Cellen kunnen worden gefractioneerd via magnetische kraal selectie of FACS volgens standaard technieken die op dit punt in het protocol.
Voor transplantatie, leveren cellen via retro-orbitale of staartader injectie om Rag-2/gc gebrekkige ontvangers (met een gewicht tussen 15-22 gram) onderworpen aan een splitsing dosis van 9,25 Gy bestraling van 2,5 uur. uit elkaar.

Opmerking: Het is essentieel dat het gewicht van de dieren vallen tussen 15 tot 22 gram op het moment van bestraling. Als ze groter zijn dan 22 gram, zal 9,25 Gy niet een voldoende dosis van de bestraling naar de juiste ablatie te waarborgen en cellen niet bemiddelen redden van dodelijke bestraling en / of inenten van de hematopoietische compartiment. Als verplanten grotere dieren, moet de juiste stralingsdosis experimenteel worden bepaald.
Een minimale dosis van 2-5 x 10 ⁶ cellen / dier is nodig om te redden garantie van dodelijke straling. Als het fractioneren cellen, injecteren 2-5 x 10 ⁶ cell-equivalenten (bijvoorbeeld als de bevolking van belang 10% van de niet-gefractioneerde pool van cellen vertegenwoordigt, injecteren 2-5 x 10 ⁵ cellen / dier).

Opmerking: Als het injecteren van> 2 x 10 ⁶ cellen, Volg bij het injecteren via staartader te teratoom vorming in een baan, die kan ontstaan wanneer grote aantallen cellen zijn retro-orbitaal geleverd te vermijden.
Onderhouden Rag-2 ^{- / - /} gc ^{- / -} deficiënt ontvangers in geautoclaveerd kooien. Afhankelijk van de 'netheid' van de Dierenverblijf, post-transplantatie dieren kan de toediening van aangezuurd water of Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) nodig heeft voor de 5 weken na de dodelijke straling.
Verwachten dat> 90% GFP + ES-afgeleide leukocyten in het perifere bloed 3 weken na de transplantatie. Aanslaan moet multi-lijn, hoewel lymfocyten is bekend dat retrovirale HoxB4-IRES-GFP stilte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc