Biology

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Abstract

Una célula madre se define como una celda con la capacidad de los auto-renovación y generar progenie diferenciada múltiples. Las células madre embrionarias (ESC) se derivan del blastocisto del embrión temprano y son pluripotentes en la capacidad de diferenciación. Su potencial de diferenciación amplia ha convertido en el foco de muchas investigaciones se centraron en deducir cómo persuadirlos para generar tipos celulares de utilidad clínica. La derivación con éxito de células madre hematopoyéticas (HSC) de la ESC de ratón ha sido recientemente realizado y se puede visualizar en este protocolo de vídeo. HSC, podría decirse que la población clínicamente más explotadas de células, se utilizan para tratar una gran variedad de cánceres hematopoyéticos y trastornos. Sin embargo, muchos pacientes que podrían beneficiarse de la terapia de HSC no tienen acceso a los donantes adecuados. ESC podría proporcionar una fuente alternativa de células madre hematopoyéticas para estos pacientes. El siguiente protocolo establece una línea de base que ESC-HSC puede estudiar e informar a los esfuerzos para aislar a HSC de humano ESC. En este protocolo, el CES se diferencian como cuerpos embrioides (EBS) durante 6 días en suero disponible en el mercado pre-seleccionados para la diferenciación hematopoyética óptima. EBs luego se disocia y se infectaron con HOXB4 retroviral. Infectados procedentes EB-células son colocadas en OP9 estroma, una línea de células del estroma de médula ósea derivada de la bóveda craneal de M-CSF-/ - ratones, y co-cultivadas en presencia de la hematopoyesis la promoción de las citoquinas durante diez días. Durante este co-cultivo, las células infectadas ampliar en gran medida, lo que resulta en la generación de un grupo heterogéneo de 100s de millones de células. Estas células se pueden utilizar para rescatar a los ratones irradiados letalmente y reconstituir.

Protocol

La diferenciación de células madre embrionarias

Recoger un frasco de cerca confluente de células madre embrionarias (ESC) a través de un tratamiento con tripsina ESC.
Resuspender las células en 5 ml de medio de diferenciación y de traslado a un T25 recubierto de gelatina. Se incuba a 37 ° C durante 45 minutos. Recuperar el sobrenadante y recoger las células por centrifugación.

Nota: fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de las culturas ESC conectar fácilmente a la T25 no recubiertos de gelatina y por lo tanto se agotan de la cultura durante esta etapa de revestimiento. Si usted no es el cultivo de la ESC en MEFs, puede omitir la placa de pre-.
Resuspender MEF-agotado ESC en los medios de diferenciación en 333.333 cells/50 ml. Esta concentración resulta en 100 ml ESC/15.
El uso de múltiples canales pipeta, la placa de ESC a 100 ml cells/15 caída de 15 cm ² placas de petri. Con una pipeta de 8 canales, debe ser capaz de encajar unos 18-22 filas de gotas por la placa (unos 5 ml por placa).

Nota: Para este protocolo, 2-5 15 cm ² platos de gotas será más que suficiente y debe producir 2.5 x 10 ⁶ seis días de deriva EB-células.
Estirar suavemente las placas para invertir gotas. Se incuba a 37 ° C 5% CO ₂ durante 48 horas.
Piscina cae girando suavemente las placas y la transferencia a 15 ml tubo cónico. Enjuagar las placas con 4-6 ml de PBS y añadir a la misma cónico de 15 ml.

Nota: Es posible que la piscina en hasta cinco placas de gota. El EBS crecerá a medida que continúan diferenciar y si son muy concentrados que tienden a formar grupos grandes.
Permitir agrupados EBs de resolver por la gravedad (aproximadamente 10 minutos). Aspirar el sobrenadante sin perturbar EBS. Resuspenda suavemente en 10 ml de medio de diferenciación y de transferencia de hasta 10 cm no adherentes placa de Petri.
Lugar de Petri placa en placa de agitación a 50 rpm y se incuba a 37 ° C 5% de CO _2.
24 horas más tarde (de cuatro días de diferencia), las placas de remolino para concentrarse EBs en el centro de placa de Petri. Cuidado de cambio del 50% de los medios de comunicación (5 ml) con 5 ml de medio de diferenciación fresco. Vuelva a colocar a la incubadora durante dos días más.

EB disociación y la infección con MSCV-HOXB4-IRES-GFP

En el sexto día de la diferenciación, la transferencia de EBs de tubo cónico de 15 ml. Se deja sedimentar por gravedad.
Aspirar los medios de comunicación y resuspender en 10 ml de PBS. Permitir EBs para reasentar por la gravedad. Aspirar PBS.
Añadir 250 ml de mezcla de enzimas disociación y 1 ml de PBS. Incubar en baño de agua 37 ° C durante 20 minutos, girando el tubo para mezclar las enzimas y EBS.
Añadir 8 ml de la enzima sin buffer de disociación.
Triturar la mezcla con 5 ml pipeta hasta EBs son totalmente disociados (alrededor de 10 veces; pipeteo excesivo aumento de la muerte en el EB-derivados de preparación de células).
1. Mezcla será nublado con células como EBS se disocian.
2. La colocación de punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo cónico durante la trituración se creará una fuerza de corte que facilitará en gran medida la disociación.
Recoger las células por centrifugación.
Resuspender las células derivadas de EB en 5 ml de 10% y el recuento de IMDM con azul de tripan exclusión

Nota: Entre los días cuatro y seis días de diferenciación, EBs cavitación que se traduce en una gran cantidad de apoptosis y death.Thus celular, en el sexto día, más del 30% de EB-derivados de las células puede manchar con azul tripán.
Resuspender las células derivadas de EB a 100.000 células / 2 ml de 10% IMDM + sobrenadante viral tal que una MOI de 5.10 es achieved.Add sulfato de protamina para una concentración final de 8 mg / ml.

Nota: Prepare suficiente EB / mezcla de sobrenadante viral a la placa de cuatro placas de 6 pocillos (suponiendo 2 ml / pocillo).
Placa de 2 ml EB / mezcla de sobrenadante viral por pozo de cuatro placas de 6 pocillos pre-plateado con OP9 células del estroma (ver más abajo).
Centrifugar las placas a 2500 rpm a temperatura ambiente durante 90 minutos. Transferencia de las placas a la incubadora a 37 ° C 5% de CO _2.
4-6 horas más tarde, la cosecha sobrenadante de las placas y recoger las células que quedan en suspensión potencial a través de centrifugación.
Resuspender pellet (puede ser pequeño) en 48 ml IMDM 10% + citoquinas. Prescindir de 2 ml / pocillo de la resuspensión de original de cuatro placas de 6 pocillos en los que la infección se realizó y el sobrenadante se recogió.

Nota: Siempre prepare un 10% IMDM + citoquinas fresco en el momento de su uso.
Incubar las placas a 37 ° C 5% CO ₂ durante siete días. Las colonias deben ser evidentes después de la infección por cuatro días y grandes y bien formados por siete días. Una fuerte expansión debe ceder 40-60 colonias / y el día siete.
El séptimo día después de la infección, recoger todas las células y la piscina (incluyendo OP9 estroma) de todos los pozos por tratamiento con tripsina.

Nota: NO desechar el sobrenadante o PBS se lava las empleadas durante la tripsina treatment.At este punto de la cultura, algunas colonias pueden ser de baja adherencia y hay muchas células floating en suspension.Collect y la piscina todos los lavados y el sobrenadante para asegurarse de que no hay células potencialmente valiosos se descartan.
Resuspender las células en 8 ml IMDM fresco 10% + citoquinas. Distribución de 2 ml / frasco en cuatro frascos T75. Añadir otros 13 mL 10% las citoquinas + IMDM a cada frasco. Se incuba a 37 ° C 5% de CO ₂ durante tres días (un total de diez días después de la infección).

La cultura y de las planchas de OP9 estroma

Mantener OP9 estroma de acuerdo a los protocolos estándar en un 20%-MEM. OP9 células cambiar las propiedades cuando se cultivan hasta la confluencia. Siempre se divide en un 80% de confluencia en no más de 1:03 de división.
24 horas antes de la infección de los Seis Días derivados EB-células con MSCV-HOXB4-IRES-GFP, placa 25000 OP9 células / pocillo de cuatro placas de 6 pocillos en un 20% al MEM.

Recolección, fraccionamiento y el trasplante

Recoger células expandidas en OP9 estroma durante diez días a través de un tratamiento con tripsina. Recuento de células.

Nota: NO desechar el sobrenadante o PBS se lava las empleadas durante el tratamiento con tripsina. En este punto de la cultura, algunas colonias pueden ser de baja adherencia y hay muchas células flotando en la piscina suspension.Collect y todos los lavados y el sobrenadante para asegurarse de que no hay células potencialmente valiosos se descartan.

Nota: Una buena expansión debería producir entre 40-50 x 10 ⁶ células / original de 6 pocillos infectados, para un total de 160 a 200 x 10 ⁶ células.
Las células pueden ser fraccionado a través de la selección con bolas magnéticas o FACS de acuerdo con las técnicas estándar en este momento en el protocolo.
Para el trasplante, proporcionar células a través de retro-orbital o de inyección de vena de la cola a los destinatarios Rag-2/gc deficiente (con un peso entre 15-22 gramos) sometidos a una dosis fraccionada de 9.25 Gy de irradiación 2,5 horas. de distancia.

Nota: Es muy importante que el peso de los animales se encuentran entre 15 a 22 gramos en el momento de la irradiación. Si son mayores de 22 gramos, 9,25 gy no será una suficiente dosis de radiación para asegurar la ablación adecuado y las células no pueden mediar rescate de irradiación letal y / o injertar el compartimiento hematopoyético. Si el trasplante de animales más grandes, la dosis de irradiación adecuada debe determinarse experimentalmente.
Una dosis mínima de 5.2 x 10 ⁶ células / animal está obligado a garantizar de rescate de la irradiación letal. Si las células de fraccionamiento, inyectar 2.5 x 10 ⁶ células equivalentes (por ejemplo, si la población de interés representa el 10% de la piscina no fraccionada de las células, inyectar 5.2 x 10 ⁵ células / animal).

Nota: Si la inyección> 2 x 10 ⁶ células, SIEMPRE se inyectan a través de vena de la cola para evitar la formación de teratoma en órbita, que tiene lugar cuando un gran número de células se entregan retro-orbital.
Mantener Rag-2 ^{- / -} / gc ^{- / -} deficientes en receptores de jaulas autoclave. Dependiendo de la "limpieza" de las instalaciones de animales, después del trasplante los animales pueden requerir la administración de agua acidificada o Trimethiprim Sulfasoxazole (Septra) para las 5 semanas después de la radiación letal.
Espera> GFP 90% + ES derivados de leucocitos en sangre periférica a las 3 semanas después del trasplante. El injerto debe ser multi-linaje, aunque se sabe que los linfocitos silencio retroviral HOXB4-IRES-GFP.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc