Summary
단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.
Abstract
단백질 전달 기술은 포유 동물 세포에 생물 학적 활성 물질의 직접 전송을 가능하게 [검토 1,2 참조]를. 이것은 소위 세포 관통 펩티드 (CPPs)의 translocating 능력을 사용 할 수 들면, 또한 단백질 전달 도메인 (PTDs)로 지정. 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV - 1) 태트 (전사의 횡단 활성제) 단백질이 널리 사용되고 있습니다 파생된 문신 - CPP. 적극적으로 청구 문신함으로써 endocytosis 또는 / 및 직접 멤브레인 보급률 2 세포 멤브레인의 장벽을 극복 세포 투과성을 촉진합니다. 핵 지방화 신호와 함께 (NLS) 융합 단백질은 핵 전시 기능을 입력할 수 있습니다. 우리의 비디오 프레 젠 테이션 세포 투과 단백질 공학, 건설, 생산 및 DNA - 수정 효소 Cre 호텔의 세포 투과 버전의 응용 프로그램에 대한 예증으로 보여줍니다.
CRE는 체외에서 생체내의 포유 동물 세포의 34 기본 쌍의 loxP 사이트를 인식하고 재결합 수있는 특정 사이트 recombinase입니다. 따라서 Cre 호텔 / loxP 시스템은 널리 조건 살아있는 세포 3,4의 게놈의 변이를 유도하는 데 사용됩니다. 세포 활성 Cre 호텔 recombinase의 배달 그러나, 제한을 나타냅니다.
우리는 유전자 수준의 관심을 직접 삽입이 가능하고 신속하게 편리하고 표준화된 방식으로 벡터 내에서 사용되는 다른 도메인과 태그를 복제하는 플랫폼을 제공 pSESAME 벡터 시스템을 설명합니다. 다른 태그 재정렬하면 높은 수율과 더 나은 용해도를 달성하는 가능성을 제공하는 융합 단백질의 생화 학적 속성을 수정 표시되었습니다. 우리와 E. 대장균에서 재조합 세포 permeant 단백질을 표현하고 정화하는 방법을 보여줍니다. 재조합 단백질 Cre 호텔의 기능은 마침내 세포 recombinase 활동을 평가하여 세포 배양에 확인됩니다.
Protocol
발현 벡터와 표현의 건설 :
pSESAME - Cre 호텔 표현 벡터는 표준 복제 방법을 사용 AvrII 및 NheI 제한 사이트를 통해 pSESAME에 Cre 호텔 - 인코딩 조각을 삽입하여 건설되었습니다. pSESAME은 히스티딘 태그, 두드리는 소리 - 도메인, NLS 시퀀스와 Cre 호텔, 약식 HTNCre 구성된 융합 단백질을 인코딩합니다. HTNCre 표현에 대한 pSESAME - Cre 호텔은 튜너 (DE3) pLacI로 변환 및 글리세롤 주식을 준비하는 데 사용되었다.
- 이상 박 문화 글리세롤 주식의 변형 박테리아와 코팅 pipet 팁을 사용하여 주사를했다. 이상의 밤 문화는 0.5 %의 포도당과 보충 LB 미디어로 구성되어 [V / V] 50 μg / ML의 최종 농도에 carbenicillin 37에서 성장을 허용했다 ° 16시간를위한 C.
- 다음날 밀도 성장을 통해 밤 문화은 1 40 비율로 표현 문화를 예방하는 데 사용되었으며 37 ° C.에서 인큐베이터에 넣어되었습니다 표현 문화는 100 μg / ML의 최종 농도에서 0.5 % 포도당 [V / V]와 암피실린로 보충 TB 미디어 구성되어.
- 1.5 OD 595에서 표현 문화는 1 H.위한 0.5 MM의 IPTG로 유도했습니다
- 후 박테리아는 SLA3000 로터에서 10 분 동안 5,000 rpm으로 원심 분리에 의해 수집되었다.
- 박테리아의 알약은 마이너스 20 ° C 정화까지 저장되었습니다.
세포 투과 단백질의 정제 :
- 냉동 세균 알약은 실온에서 15 분 동안 리터 플라스크 문화 당 10 ML의 용해 버퍼에서 resuspended되었습니다.
- 실온에서 혼합하는 동안 정지 후 추가로 15 분 동안 1 MG / ML 라이 소 자임와 incubated했다.
- 25 U / ML benzonase는 나중에 추가하고 실온에서 15 분 동안 혼합하는 동안 incubated되었습니다.
- 전력의 45 %로 0.5 S 펄스와 1.5 분 얼음 sonification 후, 1 ML 차가운 tartaric 소금 버퍼 (TSB)가 당 ML 정지 신중하면서 추가되었습니다 혼합하고 얼음에서 5 분 incubated. lysate 분수 (L)의 SDS - PAGE 샘플 찍은.
- 걷어 lysate는 ° C 30 분 30,000 G. 4 원심 분리하여 얻은 가용성 (S)과 불용성 분수 (I)의 SDS - PAGE 샘플가 함락되었다.
- 뜨는은 신선한 50 ML 팔콘 튜브 안으로 옮겨졌 다가 그리고 부드럽게 4 1 H에 대한 혼합되었습니다 ° C 50 % 초기 표현 문화의 리터 당 니켈 - NTA 슬러리 2 ML과 함께.
- 현탁액은 중력 흐름 EconoPac 칼럼 (분율 흐름을 통해 (FT) 찍은의 SDS - PAGE 샘플)로 포장 및 세척 버퍼 5 침대 볼륨과 함께 두 번 씻어했다. 모두 세척 분수 (W1 & W2)의 SDS - PAGE 샘플을 채취했다.
- HTNCre 함유 분수는 SDS - PAGE 분석을위한 eluate 분율 (E)의 용출 버퍼와 샘플 3 침대 볼륨 eluted되었습니다 것은 찍은.
- 이미다졸 두 번이나 높은 소금 버퍼에 대한 용출 분획을 dialyzing에 의해 제거되었습니다.
- 단백질 솔루션은 더욱 두 번 글리세롤 버퍼에 대한 dialyzing로 집중되었다. 모든 투석 단계에서 샘플로 버퍼의 비율은 최소한 50되었다. 이 절차는 200 450 μm의 사이에 평소와 농도에 HTNCre를 포함하는 글리세롤 주식 솔루션으로 이어지는, 즉 표현 문화 1 리터 단백질 ~ 12 MG가 발생합니다. SDS - PAGE 분석을위한 글리세롤 주식 (GS)의 샘플을 수집했다. HTNCre 주식 솔루션은 마이너스 20 저장할 수 있습니다 ° C.
그림 1 : Cre 호텔 recombinase의 정화 과정을 통해 수집된 샘플의 SDS - PAGE 분석. Cre 호텔 표현의 유도는 lysate 소수의 지배적인 밴드로 표시됩니다. 단백질의 일부는 불용성이지만 eluate과 글리세롤 주식 분수 모습으로 Cre 호텔 단백질이 더 풍부하게하실 수 있습니다. L : Lysate, I : 불용성, S : 뜨는, FT : 흐름 -을 통해, W : 세탁, E : Eluate, GS : Gylcerol 주식. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
murine 배아 줄기 (ES) 세포에 단백질 전달 :
- 조건부 β - Galactosidase 기자 다섯 구조를 갖고 ES 세포가 자기편 세포의 분리에 대한 TrypLE ™ Express를 사용하여 단일 세포로 씨앗을 품고 있었다. 4~6시간 후 세포가 다시 연결했고 매체가 삭제되었습니다.
- 이후 ES 세포는 16 시간 동안 HTNCre 함유 매체와 incubated했다.
- 글리세롤의 품절 HTNCre 단백질의 적절한 금액 (10 μm의에 해당)은 ES 매체와 이후 살균 filtrated (0.22 μm의)에 희석되었다.
- 단백질 전달 매체는 정상적인 성장 매체로 변경되었습니다 후.
- 이틀 세포는 PBS로 씻어 10 분 4 % Paraformaldehyde (PFA)가 수정되었습니다 후에.
- 두 addiX - 걸의 얼룩이 수행되기 전에 PBS로 세척 tional 단계를 수행했다.
- 고정 세포 X - 걸의 얼룩 솔루션 6 층 덮여 37 ° C. 밤 동안 incubated되었습니다
대표 결과 :
다음 날 X - 걸의 얼룩 솔루션은 했잖아요되었으며 세포는 현미경 분석을위한 PBS의 레이어로 쓰여져있었습니다. recombined 세포의 80-100%는 β - Galactosidase의 활동에 의해 판단 murine ES 세포 내에서 관찰 수 있습니다.
Discussion
Cre 호텔 융합 단백질의 정화 과정에서 그것은 원심 분리하기 전에 얼음 차가운 TBS 버퍼의 추가를 생략하지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 Cre 호텔 recombinase는 글리세롤 버퍼 내에 침전하는 경향이있다.
eluate 분율이 될 나타나는 경우 솔루션을 다시 해제 때까지 융합 단백질 추가 용출 버퍼의 높은 농도로 인해 흐린이 추가되어야합니다.
Cre 호텔 융합 단백질의 10 μm의의 응용 프로그램은 일반적으로 80-100%의 재조합 효율을 초래합니다. 소태아 세럼 (FCS)는 ES 세포 매체의 주요 구성 요소가되는 것은 강력하게 단백질 전달을 억제. Cre 호텔 recombinase의 따라서 고농도 사용할 수 있었다. 혈청이없는 조건에서 작업할 때 더 적은 단백질 (0.5-2 μm의)는 유사한 재조합 효율을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.
손에 pSESAME 벡터 시스템과 하나가 같은 Oct4와 Sox2 7 Scl/Tal1 8로 전사 요인 등 다른 단백질로 단백질 전달의 기법을 적용할 수 있습니다.
Acknowledgments
우리는 올리버 Brüstle 및 줄기 세포 공학 그룹, 지원 및 귀중한 토론 본 대학의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 SDS - PAGE 및 프로젝트 전반에 걸쳐 지속적인 지원의 준비에 대한 사빈 쉥크 감사합니다. 니콜 러스와 안나 Magerhans 뛰어난 기술 지원을 제공했습니다. 또한, 우리는 영화의 생산을위한 안드레아스 바, 쉴라 머텐스 감사하고 싶습니다. 이 작품은 폭스바겐 재단 (AZ I/77864) 및 교육과 연구의 독일 교육부 (BMBF, 01 GN 0813)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen, EMD Millipore | 70625 | |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 3783.2 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth Gmbh | T876.1 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| HCl | Carl Roth Gmbh | 4625.1 | |
| Imidazol | Carl Roth Gmbh | X998.4 | |
| NaCl | Carl Roth Gmbh | 9265.2 | |
| Yeast Extract | Carl Roth Gmbh | 2363.4 | |
| Trypton/Pepton | Carl Roth Gmbh | 8952.4 | |
| K2HPO4 | Carl Roth Gmbh | P749.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth Gmbh | 3904.1 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | 6344.2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | ||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | |
| EconoPac columns | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Sterile filter 0,22μm | Whatman, GE Healthcare | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | ||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | ||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | ||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | ||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | ||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | ||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | ||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | ||
| ESGRO (LIF) | EMD Millipore | ||
| NEAA | GIBCO, by Life Technologies | 11140035 | |
| L-Glutamin | GIBCO, by Life Technologies | 25030024 | |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 31350010 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960044 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | ||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-3367 | |
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-9387 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| X-Gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
References
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