Summary
Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan dat vergemakkelijkt de behandeling van
Abstract
Hoge-resolutie, celtype-specifieke analyse van genexpressie vergroot begrip van de ontwikkelings-regelgeving en reacties op prikkels uit de omgeving in een meercellig organisme. In situ hybridisatie en reportergen visualisatie kan in beperkte mate worden gebruikt voor dit doel, maar voor hoge resolutie kwantitatieve RT-PCR of high-throughput transcriptoom-brede analyse van de isolatie van RNA uit bepaalde celtypen is vereiste. Cellulaire dissociatie van weefsel expressie brengen van een fluorescerend eiwit marker in een bepaald celtype en de daaropvolgende Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) maakt het mogelijk om voldoende hoeveelheden materiaal te verzamelen voor RNA-extractie, cDNA synthese / versterking en microarray analyse.
Een uitgebreide set van celtype-specifieke tl-reporter-lijnen is beschikbaar voor de plant onderzoeksgemeenschap. In dit geval worden twee marker lijnen van de Arabidopsis thaliana wortel gebruikt: P SCR:: GFP (endodermis en rust midden) en P WOX5:: GFP (quiescent center). Grote aantallen (duizenden) van zaailingen zijn hydroponically of op agarplaten geteeld en geoogst om voldoende wortel materiaal voor verdere analyse te verkrijgen. Cellulaire dissociatie van plantmateriaal wordt bereikt door enzymatische afbraak van de celwand. Deze procedure maakt gebruik van een hoge osmolariteit-geïnduceerde plasmolyse en commercieel beschikbaar cellulasen, om pectinasen en hemicellulasen vrijkomen protoplasten in de oplossing.
FACS van GFP-positieve cellen maakt gebruik van de visualisatie van de groene versus de rode emissie spectra van protoplasten opgewekt door een 488 nm laser. GFP-positieve protoplasten kunnen worden onderscheiden door hun verhoogde ratio van groen naar rood emissie. Protoplasten worden meestal direct gesorteerd op RNA-extractie buffer en opgeslagen voor verdere verwerking op een later tijdstip.
Deze techniek is geopenbaard worden eenvoudig en uitvoerbaar zijn. Verder wordt aangetoond dat het kan worden gebruikt zonder moeite om voldoende aantallen cellen te isoleren voor het transcriptoom analyse, zelfs voor zeer schaars celtypes (bv. quiescent center cellen). Ten slotte wordt een groei setup voor Arabidopsis zaailingen aangetoond dat in staat stelt eerdere ongecompliceerde behandeling van de planten naar cel sorteren (bijvoorbeeld voor het celtype-specifieke analyse van de biotische of abiotische stress-reacties). Mogelijke aanvullende toepassingen voor FACS van plantenprotoplasten worden besproken.
Protocol
1) Voorbereiding van het plantmateriaal
- Protoplasten kan worden afgeleid uit veel verschillende plantensoorten en weefsels op voorwaarde dat de juiste mix van celwand enzymen wordt 1 gebruikt. Voordat een full-scale experiment is uitgevoerd, een kleinschalige vertering van het materiaal is het raadzaam om de protoplasting efficiëntie van het weefsel, enzymen, enz. te evalueren en om het percentage positieve cellen voor celsortering te schatten. Hier, protoplasten afgeleid van de wortels van Arabidopsis thaliana zaailingen dat celtype specifiek-express groen fluorescerend eiwit (GFP) worden gebruikt. De endodermis en quiescent center worden gekenmerkt door P SCR:: GFP en het quiescent center door P WOX5:: GFP 2,3 (figuur 1).
- Zaailingen hydroponically gekweekt in phytatrays (Sigma, figuur 2a) op een nylon filter (250 micrometer mesh; NITEX), waarmee de wortels groeien door in het groeimedium (0,22% w / v Murashige en Skoog basismedium [Sigma], 1% w / v sucrose, 0,05% w / v MES [2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur], pH 5,7 met KOH). Als alternatief kunnen planten worden geteeld op de top van een nylon filter (100 um mesh) in verticaal geplaatst 1% agar platen (Figuur 2b).
- Het gebruik van de bovengenoemde filters niet alleen helpt bij de oogst van de wortels, maar vergemakkelijkt ook eenvoudig extra behandeling van de zaailingen, indien gewenst. De filters kan de zaailingen te dragen massaal naar nieuwe phytatrays of agar platen aangevuld met een katalysator van belang. Bijvoorbeeld, de phytatray opgezet is gebruikt voor celtype-specifieke analyse van de transcriptionele respons op stikstof behandeling in Arabidopsis zaailingen 4.
- Zorg ervoor dat uw microscopisch fluorescente marker correct wordt uitgedrukt (vooral bij gebruik van de behandeling optie, omdat het celtype-specifieke merkers zelf zou kunnen worden beïnvloed door de behandeling). In dit geval worden zaailingen geïnspecteerd onder een fluorescentie microscoop (Nikon, figuur 1). Merk op dat celtype-specifieke fluorescente marker lijnen moeten in eerste instantie worden gekarakteriseerd onder een confocale microscoop om precies welke celtypen zijn gemarkeerd te bepalen en te bepalen variabiliteit in expressie.
2) Voorbereiding van de protoplasting oplossing
- Los 1,25% w / v Cellulase (Yakult), 0,3% w / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-mannitol, 20 mM MES en 20 mM KCl (van een 1 M stock) in gedemineraliseerd water en breng de pH op 5,7 met 1 M Tris / HCl pH 7,5. Deze oplossing zal enigszins worden troebel.
- Verwarm de oplossing tot 55 ° C gedurende 10 minuten (de oplossing zal blijken helder) en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur voor het toevoegen van 0,1% w / v BSA (bovine serum albumine), 10 mM CaCl 2, en 5 mM β-mercapto-ethanol .
3) Oogst en protoplasting van het plantmateriaal
- De wortels worden geoogst door schrapen ze af van de nylon mesh met een scalpel en gestort in een kolf met de protoplasting oplossing. Over het algemeen is 10 ml van de oplossing die wordt gebruikt protoplasting per 1500 zaailing wortels.
- Schud de kolven zacht (75 rpm) bij kamertemperatuur gedurende een uur. Een langere incubatietijd kan het protoplast opbrengst, maar zal ook bijdragen aan het effect van protoplasting zich op genexpressie.
- Filter de protoplast oplossing met een 40 um cel zeef (BD Falcon) en verdeel de oplossing over conische 15 ml buizen (BD Falcon).
- Spin de buizen in een swing-emmer centrifuge gedurende 10 minuten op 500 G. Merk op dat dit centrifugeersnelheid zal afhangen van de aard van de protoplasten wordt gebruikt, hun kwetsbaarheid en de hoeveelheid celafval geproduceerd tijdens de enzymatische behandeling.
- Verwijder het merendeel van het supernatans, resuspendeer de protoplasten in de resterende oplossing en microscopisch inspecteren (figuur 3).
- Maak gebruik van een hemacytometer om het aantal en de dichtheid van protoplasten te schatten. De cel dichtheid bepaalt injecteren van een monster snelheid van de gebeurtenissen per seconde snelheid en dus de totale tijd die nodig is om de cellen op de FACS sort (zie ook rubriek 4.3).
- 3.7) Ofwel direct doorgaan met FACS of wassen en de protoplasten resuspendeer in een incubatie-oplossing, zoals W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM MES, breng de pH op 5,7 met KOH) of protoplasting oplossing zonder de toegevoegde enzymen. Zeker als we kijken naar transcriptionele veranderingen, is het van belang om het minimaliseren van de blootstelling van de monsters naar voorwaarden die genexpressie kunnen beïnvloeden, zoals het veranderen van de buffer de protoplasten worden gehouden inch Het is daarom aanbevolen om de protoplasten te houden protoplasting oplossing en door te gaan naar FACS zo snel mogelijk.
4) Fluorescentie Activated Cell Sorting van protoplasten
- Schakel en de voorbereiding van de cel sorter. Hier is een FACSAria (BD) gebruikt.
- Stel een stroom met een 100 & mU; m nozzle en een 20 psi schede druk.
- De cel dichtheid en injecteren van een monster snelheid kan worden aangepast aan de specifieke experiment op basis van de vraag of een zo goed mogelijke rendement of snelste haalbare snelheid gewenst is. We hebben met succes gesorteerd met dichtheden tot 10 miljoen cellen / ml.
- Gebruik het monster agitatie optie op de FACS om sedimentatie van de protoplasten te voorkomen. Als verstopping van de FACS is een probleem, zijn er drie mogelijke stappen voor probleemoplossing: 1. Voer een sample-lijn backflush. 2. Verdun je protoplast vering om de dichtheid te verlagen. 3. Het schoonmaken van de protoplast oplossing door de filtratie stap (3.3) na het centrifugeren en resuspensie.
- Bereid het apparaat naar voren te strooien (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) en de emissie bij 530/30 nm voor GFP en 610/20 nm voor de rode spectrum autofluorescentie (RSA) na excitatie te meten door een 488 nm laser. Deze zijn in essentie de enige parameters die worden gebruikt om GFP-positieve protoplasten te isoleren. Hier, de spanning instellingen zijn als volgt: FSC - 60V, SSC 250V, 350V GFP en RSA 335V. Merk op dat de optimale voltage instellingen verschillend zijn voor elke FACS en zal zelfs moeten worden aangepast gedurende de hele levensduur van de cel sorter.
- Begin met het opzetten van een dotplot voor voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing. Breng de voltage-instellingen, zodat de gemeten gebeurtenissen in het midden van de plot.
- Maak vervolgens een dot plot van groene versus rode fluorescentie signalen. Breng de voltage-instellingen, zodat de gemeten gebeurtenissen een gecentreerde diagonaal bevolking in de plot opbrengst bij het kijken naar een wild-type (niet-GFP) protoplast schorsing. Een protoplast schorsing afgeleid van een GFP-marker lijn zal een duidelijke populatie van groen fluorescent gebeurtenissen nooit gezien in wild-type monsters.
- Stel vergoeding beperkingen aan te passen voor de spectrale overlap tussen de GFP en RSA. Een behoorlijke schadevergoeding beperking instellingen zorgen voor een betere scheiding van het GFP-positieve protoplasten van de niet-GFP protoplasten en puin. De beperkingen die hier gebruikt zijn als volgt: RSA, minus 17,91% GFP.
- Stel een poort naar de GFP-positieve gebeurtenissen, een negatieve controle van niet-GFP protoplasten moet worden gebruikt om te helpen bij het definiëren van de poort grenzen (figuur 4) te identificeren.
- Implementeer een voorwaartse verstrooiing cutoff om kleine brokstukken weglaten van de analyse. Visualiseer de GFP-positieve gebeurtenissen in de FSC vs SSC plot om de plaatsing van de cutoff te bepalen. Hier was de cutoff vastgesteld op 5000. Merk op dat de FACS zal puin tellen als een soort evenementen en een monster met een hoog niveau van puin kan een ander percentage GFP-positieve gebeurtenissen dan verwacht. Dit is niet noodzakelijk een probleem. Echter, de meer puin in de steekproef, hoe langer het soort zal duren.
- Afhankelijk van het experiment en de overvloed van het celtype te analyseren, ofwel zet de FACS precisie-modus voor een optimale opbrengst of een optimale zuiverheid van de gesorteerde cellen.
- Voor RNA-extractie, voor te bereiden verzameling buizen (1,5 ml microfugebuisje buizen) met de juiste hoeveelheid van de RNA-extractie buffer. Met deze opzet, zal 20.000 sorteren gebeurtenissen leveren een totaal volume van ongeveer 100 ul die werden ondergebracht in 350 ul extractiebuffer (RNeasy micro kit, QIAGEN). Meng monsters na afloop van de soort als celsuspensie kan zwembad aan de top.
- Bewaar monsters of ga direct naar extractie RNA. Succesvolle microarray analyses zijn voorgevormd met de RNA geëxtraheerd uit zo weinig als 500 gesorteerd evenementen. Hier gebruikten we een RNeasy micro-extractie kit (Qiagen), de WT-Ovation Pico RNA Amplification System en FL-Ovation cDNA Biotine Module V2 (NuGEN).
Representatieve resultaten
Een phytatray van ongeveer 1.500 een-week-oud P SCR:: GFP zaailingen leverde ongeveer 60.000 protoplasten (zoals gemeten door hemacytometer). 2,6% van 65.000 FACS-verwerkt evenementen werden gedefinieerd als GFP-positieve en werden gesorteerd (figuur 4b).
Acht platen van ongeveer 1.500 vier-dagen-oude P WOX5:: GFP zaailingen elk (12.000 totaal) leverde ongeveer 30 miljoen protoplasten (zoals gemeten door hemacytometer). 0,063% van 16 miljoen FACS-verwerkt evenementen werden gedefinieerd als GFP-positieve en werden gesorteerd (Figuur 4c).
10.000 gesorteerd evenementen worden doorgaans gebruikt voor RNA-extractie en kunnen opbrengst 20 tot 140 ng totaal RNA (figuur 5).
Figuur 1. Celtype-specifieke marker GFP lijnen in de Arabidopsis wortel. Fluorescentie microscopie foto's zijn genomen met differentieel interferentie contrast (DIC) en een GFP filter op een Eclipse 90i microscoop (Nikon) draait op Metamorph software (Molecular Devices). Het DIC en GFP beelden werden overtrokken voor visualisatie doeleinden. De twee lijnen marker gebruikt in dit visuele experiment worden getoond;a) P SCR:: GFP en b) P WOX5:: GFP.
Figuur 2. Plantengroei omstandigheden. Zaailingen werden gekweekt in een milieu-controller hydroponically in phytatrays (een) of op verticaal geplaatste agar platen (b).
Figuur 3. Plantenprotoplasten uiten van GFP. Fluorescentie microscopie foto's zijn genomen met differentieel interferentie contrast (DIC) en een GFP filter op een Eclipse 90i microscoop (Nikon) draait op Metamorph software (Molecular Devices). Het DIC en GFP beelden werden overtrokken voor visualisatie doeleinden. Pijlen geven een uitbarsting cel, puin en een GFP-positieve protoplast. De afstand tussen de twee witte lijnen is 50 micrometer.
Figuur 4. Fluorescentie geactiveerde cel sortering van GFP-positieve protoplasten Protoplasten afgeleid van wild-type (a) P SCR:.: GFP (b) of P WOX5:: GFP (c) marker lijnen werden geanalyseerd en gesorteerd met een FACSAria (BD) met behulp van bepaalde poorten op een dotplot van groen (530/30 nm; x-as) versus rood (610/20 nm; y-as) fluorescentie. 100.000 evenementen worden gepresenteerd in elk perceel. De gebeurtenissen die binnen de GFP sorteren poort worden gemarkeerd groen.
Figuur 5. Vertegenwoordiger RNA extracties van 10.000 gesorteerde cellen. Cellen werden direct gesorteerd in RNA-extractie buffer (QIAGEN), werd het RNA gezuiverd en gecontroleerd op de concentratie, zuiverheid en integriteit op een 2100 Bioanalyzer (Agilent). Triplo voor beide marker lijnen worden weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protoplasten kunnen in principe worden afgeleid uit een verscheidenheid van plantaardige weefsels, het optimaliseren van gunstige voorwaarden zal sterk RNA kwaliteit en kwantiteit te verbeteren. Zowel de protoplasting oplossing en de electieve gebruikte incubatiebuffer invloed zal dit aspect.
Veel verschillende fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de mogelijkheden van de gebruikte FACS, bijvoorbeeld GFP, RFP, YFP, GVB of hun vele varianten en derivaten. De expressie van de markers kon worden gedreven niet alleen door celtype-specifieke promotors of enhancer vallen, zoals hier getoond, maar ook door uw favoriete promotor, bijvoorbeeld een hormoon reageert synthetisch reportergen 5. Tweekleurige FACS van plantenprotoplasten is ook mogelijk. Dit kan bijvoorbeeld worden toegepast bij het uitvoeren van een transiënte transformatie test met behulp van een vector met een fluorescente marker positieve selectie 5.
Protoplasten kunnen ook gesorteerd worden voor de analyse van genomisch DNA, eiwitten of metabolieten 6. Het houden van protoplasten leeft na sortering is uitdagend vanwege hun fragiele karakter, met behulp van een grotere (130 pm) nozzle en een lagere druk schede en sorteren ze in een geoptimaliseerde incubatiebuffer zal de post-soort protoplast levensvatbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (subsidie niet. DBI 0.519.984) en de National Institutes of Health (subsidie niet. 5R01GM078279) ..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
