Summary
संयंत्र सामग्री के विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से अलग करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन है. इस तकनीक को विशेष प्रकार की कोशिकाओं, सेलुलर हदबंदी और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी में ट्रांसजेनिक मार्कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त लाइनों कार्यरत हैं. इसके अतिरिक्त, एक विकास सेटअप यहाँ की स्थापना की है कि के उपचार की सुविधा
Protocol
1) संयंत्र सामग्री की तैयारी
- Protoplasts कई अलग अलग प्रजातियों के पौधे और ऊतकों बशर्ते कि कोशिका दीवार के सही मिश्रण एंजाइमों पचा 1 प्रयोग किया जाता है से प्राप्त किया जा सकता है . इससे पहले एक पूर्ण पैमाने पर प्रयोग किया जाता है, सामग्री की एक छोटे पैमाने पर पाचन क्रम में ऊतक के protoplasting दक्षता, एंजाइमों, आदि का मूल्यांकन करने के लिए और सेल छँटाई के लिए प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं का अनुमान उचित है. यहाँ, कि सेल प्रकार विशेष रूप से व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) उपयोग किया जाता है Arabidopsis thaliana seedlings के जड़ों से व्युत्पन्न protoplasts. endodermis और मौन केंद्र पी SCR द्वारा चिह्नित कर रहे हैं: GFP और WOX5 पी द्वारा मौन केंद्र: 2,3 GFP (चित्रा 1 ).
- Seedlings हाइड्रोपोनिकली phytatrays (सिग्मा, चित्रा 2a) में बड़े हो रहे हैं, जो मदद से मध्यम विकास में जड़ों के माध्यम से विकसित (0.22% w / ध् Murashige और Skoog बेसल मध्यम [] सिग्मा, 1% एक नायलॉन (NITEX 250 सुक्ष्ममापी जाल) फ़िल्टर w / ध् sucrose, 0.05% w / ध् एमईएस [2 - (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड], KOH के साथ पीएच 5.7). वैकल्पिक रूप से, पौधों खड़ी तैनात 1% अगर प्लेटों में एक नायलॉन (100 सुक्ष्ममापी जाल) फिल्टर (चित्रा 2b) के शीर्ष पर उगाया जा सकता है.
- जड़ों की फसल में न केवल एड्स के abovementioned फिल्टर का उपयोग, यह भी seedlings के आसान अतिरिक्त उपचार की सुविधा, यदि वांछित. फिल्टर seedlings नए phytatrays या अगर प्लेटें ब्याज की एक उत्प्रेरक के साथ पूरक होने के लिए सामूहिक रूप से हस्तांतरित की अनुमति देते हैं . उदाहरण के लिए, phytatray सेट अप सेल Arabidopsis seedlings में नाइट्रोजन उपचार 4 transcriptional प्रतिक्रिया के प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है .
- Microscopically कि आपके फ्लोरोसेंट मार्कर सही ढंग से व्यक्त किया जाता है (खासकर जब उपचार के विकल्प का उपयोग कर टाइप विशेष सेल मार्कर के रूप में खुद को उपचार से प्रभावित हो सकता है) सुनिश्चित करें. इस मामले में, seedlings एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (Nikon, चित्रा 1) के तहत निरीक्षण कर रहे हैं. नोट है कि प्रकार के विशेष सेल मार्कर फ्लोरोसेंट लाइनों एक confocal खुर्दबीन के नीचे जो वास्तव में सेल प्रकार के रूप में चिह्नित कर रहे हैं निर्धारित करने और अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता का निर्धारण शुरू विशेषता चाहिए.
Protoplasting समाधान के 2) तैयार करना
- भंग 1.25% w / ध् (यकुल्त) Cellulase, 0.3% w / v Macerozyme (यकुल्त), 0.4 एम डी mannitol, 20 मिमी एमईएस और demineralized पानी में 20 मिमी KCl (एम 1 स्टॉक से) और 5.7 पीएच को समायोजित 1 एम / Tris एचसीएल 7.5 पीएच के साथ. यह समाधान थोड़ा turbid जाएगा.
- 55 के लिए समाधान हीट डिग्री सेल्सियस (10 मिनट के लिए समाधान स्पष्ट बंद हो जाएगा) और 0.1% जोड़ने से पहले इसे कमरे के तापमान को शांत w / v (गोजातीय सीरम albumin) BSA, 10 मिमी 2 CaCl, और 5 मिमी β-mercaptoethanol .
3) फसल काटने वाले और संयंत्र सामग्री के protoplasting
- जड़ें उन्हें scraping एक स्केलपेल के साथ बंद नायलॉन जाल से harvested रहे हैं और एक protoplasting समाधान युक्त कुप्पी में जमा है. आम तौर पर, protoplasting समाधान के 10 मिलीलीटर 1500 अंकुर जड़ों के प्रति किया जाता है.
- एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे बोतल (75 rpm) हिलाओ. एक लंबी ऊष्मायन समय मूलतत्त्व उपज में वृद्धि, लेकिन यह भी ही जीन अभिव्यक्ति पर protoplasting के प्रभाव को जोड़ना होगा हो सकता है.
- एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी (बी फाल्कन) के साथ आदर्श समाधान फ़िल्टर और शंक्वाकार 15 मिलीलीटर ट्यूबों (बी फाल्कन) पर समाधान विभाजित.
- 500 जी नोट पर एक स्विंग बाल्टी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र है कि इस centrifugation गति protoplasts के इस्तेमाल के प्रकार, उनकी कमजोरी और सेल enzymatic उपचार के दौरान उत्पादित मलबे की राशि पर निर्भर करेगा ट्यूबों स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें, शेष समाधान में protoplasts resuspend और उन्हें निरीक्षण microscopically (चित्रा 3).
- एक hemacytometer का उपयोग करने के लिए protoplasts घनत्व की संख्या का अनुमान बनाओ. सेल घनत्व नमूना इंजेक्शन गति, प्रति सेकंड की दर घटनाओं और इसलिए FACS कोशिकाओं को सॉर्ट करने की जरूरत कुल समय (भी 4.3 अनुभाग देखें) का निर्धारण करेगा.
- 3.7) या तो FACS सीधे आगे बढ़ना या धोने और बिना protoplasts resuspend W5 (154 मिमी NaCl, 125 CaCl2 मिमी, 5 मिमी KCl, 5 मिमी एमईएस, KOH के साथ 5.7 पीएच को समायोजित) या protoplasting समाधान के रूप में एक ऊष्मायन समाधान में एंजाइमों जोडी. खासकर जब transcriptional परिवर्तन पर देख रहे हैं, यह महत्व का है बफर protoplasts अंदर रखा जाता है इसलिए यह protoplasting समाधान में protoplasts रखने के लिए और आगे बढ़ना करने के लिए सिफारिश की है बदलने के रूप में नमूनों की स्थिति है कि जीन की अभिव्यक्ति प्रभावित हो सकता है, जोखिम को कम जितनी जल्दी हो सके FACS के लिए.
4) प्रतिदीप्ति सक्रिय protoplasts के सेल छंटनी
- पर मुड़ें और सेल सॉर्टर तैयार. यहाँ, एक FACSAria (बी) का इस्तेमाल किया जाता है.
- 100 एक एंड एम के साथ एक प्रवाह धारा सेटयू, मी नोजल और एक 20 साई म्यान दबाव.
- सेल घनत्व और नमूना इंजेक्शन की गति पर आधारित है कि एक सबसे अच्छा संभव उपज या सबसे तेजी से गति प्राप्त वांछित है विशेष प्रयोग करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक 10.000.000 कोशिकाओं / एमएल घनत्व के साथ हल है.
- FACS पर नमूना आंदोलन विकल्प protoplasts के अवसादन को रोकने का उपयोग करें. : 1 यदि FACS के clogging एक मुद्दा है, वहाँ तीन संभावित समस्या निवारण चरणों हैं. एक नमूना लाइन backflush प्रदर्शन. 2. अपने मूलतत्त्व निलंबन पतला घनत्व कम है. 3. Centrifugation और resuspension बाद निस्पंदन कदम (3.3) दोहरा द्वारा आदर्श समाधान साफ करें.
- तंत्र तैयार करने के लिए एक 488 एनएम लेजर द्वारा आगे तितर बितर (FSC), ओर तितर बितर (एसएससी) और 530/30 के लिए GFP और उत्तेजना के बाद लाल स्पेक्ट्रम autofluorescence (आरएसए) के लिए यह 610/20 एनएम एनएम उत्सर्जन को मापने. संक्षेप में यह केवल पैरामीटर GFP-सकारात्मक protoplasts को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया. यहाँ, वोल्टेज सेटिंग्स निम्नानुसार थे: FSC - 60V, एसएससी 250V, GFP 350V और आरएसए 335V. नोट है कि इष्टतम वोल्टेज सेटिंग्स हर FACS के लिए अलग हो सकता है और भी सेल सॉर्टर के जीवन भर समायोजित किया जा आवश्यकता होगी.
- आगे तितर बितर बनाम ओर तितर बितर के लिए एक dotplot सेटिंग के द्वारा शुरू करो. वोल्टेज सेटिंग्स ताकि मापा घटनाओं की साजिश में केंद्रित कर रहे हैं लागू करें.
- अगला, हरी बनाम लाल प्रतिदीप्ति संकेतों के एक डॉट साजिश बनाने के लिए. वोल्टेज सेटिंग्स लागू करें ताकि मापा घटनाओं साजिश में केन्द्रित विकर्ण जनसंख्या उपज जब एक जंगली प्रकार (गैर GFP) के मूलतत्त्व निलंबन को देख. एक आदर्श एक GFP मार्कर लाइन से व्युत्पन्न निलंबन हरी फ्लोरोसेंट घटनाओं की एक स्पष्ट आबादी जंगली प्रकार के नमूनों में कभी नहीं देखा उत्पादन होगा.
- मुआवजे की कमी का सेट GFP और आरएसए के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए समायोजित. उचित मुआवजा बाधा सेटिंग्स गैर GFP protoplasts और मलबे से GFP पॉजिटिव protoplasts के बेहतर जुदाई के लिए अनुमति देगा. यहां इस्तेमाल किया बाधाओं के रूप में निम्नानुसार हैं: आरएसए, ऋण 17.91% GFP.
- एक गेट सेट GFP सकारात्मक घटनाओं, गैर GFP protoplasts के एक नकारात्मक नियंत्रण गेट सीमाओं (चित्रा 4) को परिभाषित करने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए की पहचान.
- आगे तितर बितर cutoff को लागू क्रम में विश्लेषण के बाहर छोटे मलबे छोड़. FSC बनाम एसएससी साजिश में GFP सकारात्मक घटनाओं की कल्पना करने में मदद के लिए cutoff की नियुक्ति निर्धारित. यहाँ, cutoff 5000 में स्थापित किया गया था. ध्यान दें कि FACS तरह मलबे के उच्च स्तर के साथ एक नमूना घटनाओं के रूप में मलबे गिनती होगी एक अलग प्रतिशत GFP सकारात्मक घटनाओं से अधिक की उम्मीद हो सकती है. यह एक समस्या यह जरूरी नहीं है. हालांकि, नमूना के बारे में अधिक मलबे, अब सॉर्ट ले जाएगा.
- प्रयोग की बहुतायत और सेल करने के लिए विश्लेषण किया जा प्रकार पर निर्भर करता है, FACS परिशुद्धता मोड या तो सेट इष्टतम या सॉर्ट किया गया कोशिकाओं के इष्टतम शुद्धता उपज के लिए.
- शाही सेना निकासी के लिए, शाही सेना निकासी बफर की उचित राशि के साथ संग्रह ट्यूबों (1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों) तैयार करते हैं. इस सेटअप के साथ, 20,000 छँटाई घटनाओं लगभग 100 μl जो निकासी बफर के 350 μl (RNeasy सूक्ष्म किट, QIAGEN) में हल किया गया की कुल मात्रा निकलेगा. सेल निलंबन कर सकते हैं शीर्ष पर पूल के रूप में की तरह पूरा होने के बाद नमूने मिक्स.
- नमूने स्टोर या सीधे आगे बढ़ने के लिए निष्कर्षण शाही सेना. सफल माइक्रोएरे विश्लेषण के रूप में छोटा रूप में 500 सॉर्ट घटनाओं से निकाले शाही सेना के साथ preformed है. यहाँ, हम एक RNeasy सूक्ष्म निष्कर्षण (QIAGEN) किट, पिको WT-तालियाँ आरएनए प्रवर्धन प्रणाली और FL तालियाँ - सीडीएनए बायोटिन मॉड्यूल V2 (NuGEN) का इस्तेमाल किया.
प्रतिनिधि परिणाम
लगभग 1,500 एक सप्ताह पुरानी पी SCR का एक phytatray: GFP seedlings 60,000 protoplasts (के रूप में hemacytometer द्वारा मापा) के बारे में मिले. 65,000 FACS संसाधित घटनाओं के 2.6% GFP-पॉजिटिव होने के रूप में परिभाषित किया गया और थे सॉर्ट किया गया (चित्रा 4b).
लगभग 1,500 चार दिन पुराने WOX5 पी के आठ प्लेटें: GFP seedlings प्रत्येक (कुल 12,000) 30,000,000 protoplasts (के रूप में hemacytometer द्वारा मापा) के बारे में मिले. 16,000,000 FACS संसाधित घटनाओं की 0.063% GFP-पॉजिटिव होने के रूप में परिभाषित किया गया और थे सॉर्ट किया गया (चित्रा 4c).
10,000 सॉर्ट किया गया घटनाओं आमतौर पर शाही सेना के निष्कर्षण के लिए उपयोग किया जाता है और 20 से 140 एनजी कुल शाही सेना (चित्रा 5) उपज कर सकते हैं.
चित्रा 1. सेल प्रकार विशिष्ट Arabidopsis जड़ में GFP मार्कर लाइनों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और एक ग्रहण 90i (Nikon) खुर्दबीन Metamorph सॉफ्टवेयर (आण्विक डिवाइसेज) पर चल रहा है पर एक GFP फिल्टर के साथ ले जाया गया. डीआईसी और GFP छवियों दृश्य प्रयोजनों के लिए मढ़ा गया. दो मार्कर इस दृश्य प्रयोग में इस्तेमाल लाइनों दिखाए जाते हैं;एक) पी SCR: GFP और ख) पी WOX5: GFP.
चित्रा 2. विकास की स्थिति संयंत्र. Seedlings phytatrays (एक) या खड़ी तैनात अगर प्लेटें (ख) पर एक पर्यावरण हाइड्रोपोनिकली नियंत्रक में बड़े हो रहे थे.
चित्रा 3. संयंत्र protoplasts GFP व्यक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और एक ग्रहण 90i (Nikon) खुर्दबीन Metamorph सॉफ्टवेयर (आण्विक डिवाइसेज) पर चल रहा है पर एक GFP फिल्टर के साथ ले जाया गया.. डीआईसी और GFP छवियों दृश्य प्रयोजनों के लिए मढ़ा गया. तीर फट सेल, सेल मलबे और GFP पॉजिटिव मूलतत्त्व संकेत मिलता है. दो सफेद लाइनों के बीच की दूरी 50 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 4. GFP पॉजिटिव protoplasts के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई जंगली प्रकार (एक) पी SCR से व्युत्पन्न Protoplasts: GFP (ख) या पी WOX5: (ग) GFP मार्कर लाइनों का विश्लेषण किया गया और एक FACSAria (बी) के साथ हल परिभाषित फाटक का उपयोग. बनाम लाल (610 / 20 एनएम; y अक्ष) प्रतिदीप्ति, (x अक्ष 530/30 एनएम) हरे रंग की एक dotplot पर. 100.000 घटनाओं के प्रत्येक खेत में प्रस्तुत कर रहे हैं. GFP छँटाई फाटक के भीतर गिरने की घटनाओं हरी डाला जाता है.
चित्रा 5. 10.000 कोशिकाओं से सॉर्ट किया गया प्रतिनिधि आरएनए extractions कक्ष सीधे शाही सेना निष्कर्षण बफर (QIAGEN) में हल किया गया, शाही सेना शुद्ध था और एक 2100 Bioanalyzer (Agilent) पर एकाग्रता, शुद्धता, और अखंडता के लिए जाँच . तीन प्रतिकृति दोनों के लिए मार्कर लाइनों में दिखाए जाते हैं.
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Discussion
Protoplasts, सिद्धांत रूप में, कर सकते हैं संयंत्र के ऊतकों की एक किस्म से प्राप्त किया जा, अनुकूल परिस्थितियों के अनुकूलन बहुत शाही सेना गुणवत्ता और मात्रा में वृद्धि होगी. दोनों protoplasting समाधान और वैकल्पिक ऊष्मायन बफर का इस्तेमाल किया इस पहलू को प्रभावित करेगा.
कई अलग अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन इस्तेमाल किया FACS की क्षमताओं के आधार पर हो सकता है, इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे GFP, आरएफपी, YFP, CFP या उनके कई वेरिएंट और डेरिवेटिव . मार्करों की अभिव्यक्ति न सिर्फ सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों या बढ़ाने जाल द्वारा संचालित किया जा सकता है, जैसा कि यहाँ दिखाया, लेकिन अपने पसंदीदा प्रमोटर द्वारा भी, एक हार्मोन उत्तरदायी सिंथेटिक रिपोर्टर जीन 5 उदा . संयंत्र protoplasts की दोहरी रंग FACS भी संभव है. यह, उदाहरण के लिए, जब एक क्षणिक परिवर्तन परख एक फ्लोरोसेंट सकारात्मक चयन 5 मार्कर के साथ एक सदिश का उपयोग कर प्रदर्शन कर सकते हैं लागू किया जा.
Protoplasts भी जीनोमिक डीएनए, प्रोटीन या 6 चयापचयों के विश्लेषण के लिए हल किया जा सकता है. छँटाई के बाद जीवित protoplasts रखते हुए उनके नाजुक प्रकृति की वजह से चुनौती दे रहा है, एक बड़ा (130 सुक्ष्ममापी) नोजल और कम म्यान दबाव का उपयोग और उन्हें एक अनुकूलित ऊष्मायन बफर में छँटाई के बाद सॉर्ट मूलतत्त्व व्यवहार्यता में वृद्धि होगी.
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Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान नहीं 0519984 DBI) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (अनुदान नहीं 5R01GM078279.) द्वारा समर्थित किया गया था ..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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