قياس يكمل 50 ٪ الدم الانحلالي (CH ₅₀) نشاط المصل

Summary

يتم تنشيط المسار الكلاسيكي بواسطة الأجسام المضادة ويتوج في انحلال الخلايا المستهدفة. وCH

Abstract

نظام تكمل مجموعة من البروتينات التي تؤدي الى تنشيط عندما تحلل الخلايا المستهدفة ويسهل من خلال البلعمة opsonisation. ويمكن قياس مكونات تكمل الفردية ولكن هذا لا يوفر أي معلومات عن نشاط المسار. وCH

Protocol

إعداد المالحة Veronal 5X التخزين المؤقت (VBS)

1. لإعداد المالحة Veronal التخزين المؤقت (VBS) ، وثلاثة حلول فصل ابد أن نكون مستعدين.
2. 1 إعداد حل عن طريق إذابة 21.25gm من كلوريد الصوديوم و0.94gm باربيتون من الصوديوم في 350ml من الماء المقطر. التركيزات النهائية لكلوريد الصوديوم والصوديوم وباربيتون 1.02M و13mM على التوالي.
3. 2 إعداد حل عن طريق إذابة 1.44gm من باربيتون في 125ml من الماء المقطر الساخن. التركيز النهائي هو باربيتون 62.5mM.
4. 3 إعداد حل عن طريق إذابة 20.33gm من MgCl ₂ و 4.41gm من CaCl ₂ في 100ML من الماء المقطر. التركيز النهائي للMgCl ₂ و ₂ CaCl هو 2.18M و440mM على التوالي.
5. مزيج حلول 1 و 2 وتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
6. مرة واحدة في الجمع بين الحل والمبردة ، إضافة 1.25ml الحل (3) وضبط درجة الحموضة إلى 7،3-7،5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1M.
7. ضبط الحجم النهائي ل500ml بالماء المقطر لإعداد محلول المخزون 5X.
8. لإعداد حل 1X العمل ، ويخفف من 1:05 الأسهم مع الماء المقطر.

التحسس من خلايا الدم الحمراء مع الأغنام haemolysin

1. إعداد haemolysin بواسطة تمييع أولا مع أنه 01:50 VBS
2. ل4ml من SRBC إضافة 6ml من VBS واخلطه برفق بواسطة انقلاب
3. الطرد المركزي في العاشر 5minutes 600G
4. تجاهل طاف وغسل الخلايا مرات أخرى 2
5. بعد غسل النهائي ، الطرد المركزي في الخلايا 5minutes X 900g إلى حزمة الخلايا
6. يتم تجاهل معلق وطاف resuspend الخلايا في VBS كافية لإعداد 10 ٪ 0.5ml أي حل من الخلايا معبأة في 5 مل من العازلة
7. قطرة قطرة إضافة حجم مساو من haemolysin (الأرنب مكافحة الأغنام خلايا الدم الحمراء الضد) إلى الخلايا في حين يحوم باستمرار
8. في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام ماء
9. المزيج بلطف خلايا كل 15minutes
10. ويمكن تخزين SRBC المحسس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية

CH ₅₀ مقايسة

1. التسمية سلسلة من الأنابيب مع مكررة في 1:08 ، 1:16 ، 1:32 ، 1:64 و 1:128.
2. إعداد سلسلة من التخفيفات two المسلسل أضعاف عن نطاق السيطرة واختبار المصل في VBS في كل مكررة
3. تبدأ في 1:04 (100ML المصل + 300ml VBS) ونقل 200ml من العينة في الأنبوب المسمى المقبل.
4. مزيج دقيق بين التخفيفات و200ml نقل إلى التخفيف المقبل مع طرف ماصة جديدة.
5. كرر حتى يتم إجراء كافة التخفيفات الخمسة.
6. تجاهل 200ml من التخفيف 1:128 النهائي.
7. إضافة 200ml من SRBC توعية علقت على جميع الأنابيب.
8. التسمية أنبوبين منفصلة كما فارغة وإضافة لتوعية SRBC 200ml 200ml VBS +. وهذه الأنابيب قياس تحلل عفوية من SRBC في VBS.
9. تسمية أخرى أنابيب منفصلين كما تحلل توتال وإضافة 200ml من الماء + SRBC 200ml توعية المقطر.
10. المزيج بلطف جميع الأنابيب.
11. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الاختلاط بالحمام المائي بعد 15 دقيقة.
12. الطرد المركزي العينات في 1500 ز لمدة 5 دقائق لكرات الدم الحمراء والرواسب.
13. نقل 100ML من طاف من كل أنبوب إلى بئر في 96 لوحة مسطحة القاع أيضا.
14. إضافة 100ML من الماء المقطر إلى كل بئر.
15. قراءة الامتصاصية للعينات في معمل 540nm باستخدام لوحة.

الحسابات

1. حساب الامتصاصية يعني لكل عينة
2. طرح الامتصاصية BLANK (تحلل العفوية) من جميع العينات
3. حساب تحلل ٪ لكل التخفيف باستخدام الصيغة التالية :
   
4. مؤامرة تحلل نسبة (المحور العمودي) مقابل تخفيف المصل على المحور الأفقي.
5. حساب المطلوبة لتخفيف haemolysis 50 ٪ لمراقبة واختبار المصل (الشكل 2).

ممثل النتائج :

شريط فيديو يتضمن مثالا على نتائج ممثلة. في الواقع ، هو أيضا تشغيل المصل التحكم في الوقت نفسه اختبار المصل ويتم التعامل بنفس الطريقة. أدناه (الجدول 1) بيانات عينة من عينة مصل تم اختبارها. يتلاعب البيانات وفقا للمعادلة التي قدمت في 5.3.

عينة	OD 540	متوسط
فارغة	0.042 ، 0.044	0،043
مجموع تحلل	0.183 ، 0.183	0،183
	OD 540	متوسط	يعني ، فارغ	تحلل ٪
01:08	0.200 ، 0.219	0،210	0،168	116
01:16	0.179 ، 0.173	0،176	0،134	93
01:32	0.134 ، 0.110	0،122	0.08	55
1:64	0.053 ، 0.066	0،059	0،017	12
1:128	0.044 ، 0.045	0،045	0،003	2

الشكل 1. تفعيل مسار استكمال الكلاسيكية. يتم تنشيط المسار الكلاسيكي بواسطة ربط M - المناعي (الغلوبولين المناعي) أو الغلوبولين المناعي G - (مفتش الحكومة) على سطح الخلية المستهدفة. جزء من القطعة Fc آب بربط C1q ، يتم تنشيط C1r وهذا بدوره ينشط جزيء آخر من C1r التي تنشط معا اثنين من جزيئات C1s. C1s يشق C4 الذي يعرض الآن في موقع ملزمة لC2 الذي هو أيضا المشقوق. الربط من C4b C2a ويؤدي إلى تشكيل مجمع يشار إلى كونفيرتاز C3. هذا المجمع يشق الآن C3 تشكيل C3a وC3b ، وبعضها مع الجمع بين كونفيرتاز C3 تشكيل كونفيرتاز C5. هذا المجمع الأعمال الآن على C5 ، مع C5b الناتجة ملزمة لC6 الشروع في تشكيل غشاء الهجوم المعقدة (MAC). C5b6 يعمل على C7 ، والتي تعمل بدورها على النهاية ، وعلى C8 C9 مما أسفر عن تشكيل لجنة الهدنة العسكرية النهائي. (Goldsby وآخرون ، 2003).

الشكل 2. رسم نموذج البيانات واحتساب CH50 لمراقبة واختبار عينة مصل (A) ، يتم رسم النسبة المئوية المحسوبة (٪) تحلل من السيطرة على السواء (•) واختبار () عينات مصل ضد عامل التخفيف. (ب) لحساب تحلل 50 ٪ ، ويتم رسم خط في المئة من قيمة 50 ٪ حتى يتقاطع مع خطوط الرسم البياني ثم يتم رسم خط عمودي وصولا الى التخفيف. في هذا المثال ، هناك حاجة إلى إضعاف 35 ضعفا من السيطرة وتخفيف 21.6 ضعفا لاختبار المصل لتحقيق تحلل 50 ٪. هذه البيانات تشير إلى أن هناك أقل تكمل موجودة في اختبار المصل مقارنة التحكم كما أنها تتطلب أقل تخفيف قبل التوصل تحلل 50 ٪. العينة التحكم يظهر أيضا تحلل> 100 ٪ في تخفيف 01:08. وهذا هو الأرجح بسبب تحلل ناقصة من SRBC من الماء المقطر وتحلل أكثر كفاءة من خلال عناصر مكملة.

Discussion

₅₀ CH مقايسة يخضع لتدخلات كثيرة. بعض SRBC هي أكثر هشاشة من غيرها ، مما أدى إلى haemolysis العفوية التي لا علاقة لتكملة النشاط. تقارب من الأضداد الأرنب يختلف من الكثير والكثير لمن مصنع واحد لآخر ، وهذا يؤثر على كمية من الأجسام المضادة التي تربط لSRBC. أيضا ، فإن عملية توعية SRBC مع نتائج الضد في الخلايا التي تحتوي على كميات مختلفة من الطلاء على الضد SRBC. جمع العينات والتخزين تعتبر مصدرا هاما محتملا للخطأ. مكونات مكملة مثل C1q ، C3 ، C4 و C5 وعطوب للغاية ، بحيث التعامل السليم عينة أمر بالغ الأهمية. والتعرض لفترات طويلة لحرارة انخفاض النشاط مكملا وسوف تنتج شظايا الخاملة مكونات المتممة. كما كشف العديد من مصادر خطأ ممكن ، فمن الأهمية بمكان لاختبار مصل التحكم بقيمة ₅₀ CH المعروفة في كل مرة يتم تنفيذ فحص وإعادة القيمة المقبولة للسيطرة على المصل معروف. طريقة واحدة لتحديد ما إذا كان هناك أي خلافات بين مجموعات مختلفة من SRBC وhaemolysin هو اختبار مواد الاختبار الجديد ضد عينة قياسية من المصل عدة مرات ومن ثم تحديد ما إذا كانت هناك أي تغييرات في مستوى القاعدية من haemolysis أو في قيمة ₅₀ CH لمصل السيطرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator