Summary
Stel een chronische bacteriële infectie muismodel met persisterende
Abstract
De bacteriële infectie muis model is een krachtig modelsysteem voor de bestudering van gebieden, zoals infecties, ontstekingen, immunologie, signaaltransductie, en tumorigenese. Veel onderzoekers hebben gebruik gemaakt van de colitis veroorzaakt door
Protocol
Dit protocol omvat drie delen: bacteriecultuur, muis maagsonde, en Salmonella detectie.
1. Salmonella groei conditie.
- Bereid de Salmonella Luria-Bertani bouillon (LB) Plaat uit, incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Kies een kloon van de LB plaat en in 7 ml LB in een 12 ml tube, en schud bij 37 ° C gedurende ongeveer 5 uur.
- Inoculeren 50 ml LB met 0,05 ml van een stationaire fase cultuur en incubeer bij 37 ° C zonder schudden gedurende ongeveer 18 uur.
- Spin 's nachts bacteriecultuur bij kamertemperatuur met 6000 rpm gedurende 10 minuten, schorten de bacteriën in HBSS met behulp verhouding 100:3 (LB: HBSS). Bijvoorbeeld:
Elke 50 ml LB cultuur worden gesuspendeerd in 1,5 ml HBSS. - Voor het dier maagsonde, verder te verdunnen de bacteriecultuur op 01:10-verhouding. Bijvoorbeeld:
Elke 1,5 ml LB cultuur worden gesuspendeerd in 15 ml HBSS.
2. Salmonella-infectie model *.
- Bereid de streptomycine oplossing. Elke muis krijgt 7,5 mg streptomycine in 100 pi HBSS. Bijvoorbeeld, voor te bereiden in totaal 90 mg streptomycine in 1,2 ml HBSS voor 10 muizen. Altijd wat extra volume bij het opstellen van het streptomycine oplossing.
- Te trekken water en voedsel 4 uur voor orale sondevoeding behandeling.
- Maagsonde muizen met streptomycine met 7,5 mg van streptomycine (100 ul van HBSS voor controle muizen). Pak de huid over de muis schouder stevig met de duim en middelvinger, rek het hoofd en de hals met de wijsvinger naar de slokdarm straight te maken. Richt de bal-tip van de voeding naald langs het dak van de mond en in de richting van de rechterzijde van de achterkant van de keelholte, vervolgens voorzichtig naar beneden gaan in de slokdarm en injecteer de 100 pi oplossing. Geen weerstand zou moeten worden gevoeld.
- Op 20 uur na de behandeling streptomycine, teruggetrokken water en voedsel weer voordat de muizen besmet zijn met bacteriën.
- Maagsonde elke muis met 100 ul schorsing in HBSS of behandeld met steriele HBSS (controle) door orale sondevoeding. De maagsonde procedure is hetzelfde als 2.3) maagsonde muizen met streptomycine.
* Dierproeven werden uitgevoerd door het gebruik van specifieke-pathogeen-vrije vrouwelijke C57BL / 6 muizen (Taconic, Hudson, NY) die 6-7 weken oud zijn als eerder beschreven 1. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Rochester University Comite voor de Resources (UCAR).
3. Detectie van Salmonella in de darmen.
- Verzamel muis fecale (ongeveer 100 mg).
- Overdracht fecale monster tot een 1,5 micro-centrifugebuis met 1 ml PBS en vortex krachtig.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 800 rpm. Breng de bovenstaande in een schone microfugebuis.
- Centrifugeren bij 6000 rpm voor 5min. Supernatans verwijderd en 200 pi PBS wordt toegevoegd aan de pellets en gevortexed.
- Streak de 200 ul PBS met een wegwerp cel spreader op een BBL CHROMagar plaat om Salmonella te detecteren. Salmonella species verschijnen mauve (steeg tot paars, zie figuur 1). Als 200 ul levert te veel kolonies op de plaat, gebruikt 100 ul of 50 ul voor de streep.
4. Representatieve resultaten.
Wanneer het protocol goed wordt gedaan, kan Salmonella typhimurium kolonisatie worden gedetecteerd in de muis darm meer dan 6 maanden. Salmonella kan worden gedetecteerd door fecale cultuur meer dan 6 maanden (Fig.1). Als een typische komen van dit model, body weegt verlies en dood binnen 4 weken na infectie. Afhankelijk van de Salmonella-stammen gebruikt voor infectie, kunnen sommige muizen geen overleven meer dan 6 maanden.
Figuur 1. Intestinale Salmonella in de Salmonella species verschijnen mauve (roze tot paars) in kleur, als gevolg van metabole verschillen in de aanwezigheid van de gekozen chromogenen. Andere bacteriën zijn ofwel geblokkeerd of produceren blauw-groen of kleurloze kolonies.
Figuur 2. Survival proporties van muizen die besmet zijn met Salmonella mutante stam PhoP c, c PhoP Avra-, en PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra gedurende 4 weken (28 dagen).
Tabel 1. Lichaamsgewicht van muizen die besmet zijn met Salmonella gedurende 4 weken.
| 0 | 1 week | 2 weken | 3 weken | 4 week | |
| controle | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PhoP c 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17,43 ± 1,63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP c Avra- | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17,63 ± 1,42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* In vergelijking met de controlegroep p <0,05
** Ten opzichte van de groep p <0,01 controle
Tabel 2. Salmonella-stammen die in deze studie.
| Naam | Beschrijving | Referentie of bron |
| Salmonella 14028s | Wild-type S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | Niet-pathogene complex regulator mutant | Miller et al.., 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-mutatie | Collier-Hyams et al.., 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c Avra-met aangevuld plasmide coderend voor Avra | Collier-Hyams et al.., 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor het gebruik van dit systeem, is het noodzakelijk dat de onderzoeker om te leren hoe de dieren maagsonde. We detail een methodiek voor te bereiden bacteriecultuur en maagsonde de muizen. We hebben ook laten zien hoe je de Salmonella persistentie in de gastro-intestinale (GI) stelsel te controleren. De kritische stappen in dit protocol, waaronder:
- Streptomycine-voorbehandeling: streptomycine-voorbehandeling kan ontdoen van een aantal commensale darmflora en maken de muizen gevoelig zijn voor de Salmonella-infectie 2.
- Salmonella maagsonde: voor de beginner, de maagsonde kan een uitdaging zijn. Ergens, maagsonde mislukt omdat de oplossing per ongeluk geïnjecteerd om de luchtwegen en veroorzaakt de muis dood.
- Persistent bacteriële kolonisatie: moet nauwgezet worden toegezien bacteriën in het maag-darmkanaal. In aanvulling op de muis fecale cultuur, kan de inhoud van de blindedarm ook worden gebruikt voor de detectie van Salmonella in BBL CHROMagar platen. Verzamel blindedarm inhoud wanneer de muizen worden opgeofferd na Salmonella infectie.
We hebben getest de Salmonella kolonisatie in de muis op verschillende concentraties: 1 x 10 3 kolonievormende eenheden tot en met 1 x 10 8 kolonievormende eenheden (100 ul / muis). Op 1 x 10 6 tot 10 x 10 8 kolonievormende eenheden, Salmonella was in staat om de muizen te koloniseren. Daarom, op basis van onze eerdere publicaties 1, 5 en ongepubliceerde gegevens, zal de uiteindelijke concentratie van Salmonella in deze oplossing niet worden gemeten voordat maagsonde.
In deze experimentele procedure, gebruikten we specifiek-pathogeen-vrije vrouwelijke C57BL / 6 muizen (Taconic, Hudson, NY) die 6-7 weken oud. Gebruikte bacteriestammen zijn Salmonella typhimurium wild-type stam ATCC14028s (WT-SL), niet-pathogene Salmonella mutante stam PhoP c3, PhoP c Avra-, en PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra (tabel 2). Met behulp van dit protocol, kan Salmonella typhimurium kolonisatie worden gedetecteerd in de muis darm meer dan 6 maanden (Afb. 1). Salmonella infecties en ontstekingen werden gemeten door het observeren van fecale materie en jongen gewicht. Wanneer weefselmonsters en bloed werden verzameld, was de lengte van darm gemeten als een kenmerk van darmontsteking. De gewichten van de milt en lever werden eveneens onderzocht. Muis serum cytokine werden getest door ELISA5. Verder, biochemische en moleculaire methoden worden verder gebruikt om de veranderingen van inflammatoire cytokine en pathologische veranderingen veroorzaakt door Salmonella 5 test.
Typisch, gewichtsverlies en sterfte binnen 4 weken na infectie (tabel 1). Na de Salmonella-infectie, was er aanzienlijke hoeveelheid gewichtsverlies in de bacteriële infectie groepen in vergelijking met de controlegroep zonder bacteriële behandeling (* p <0,05 of p <0,001 tabel 1). Het lichaamsgewicht werd gemeten per week. De overleving proporties 4 weken na infectie werden getoond in Fig. 2. Over het geheel genomen 92% van de muizen (n = 50) die besmet zijn met Salmonella-stammen PhoP c, 78% PhoP c Avra-, of 70% PhoP c AvrA-/AvrA + kan met persisterende Salmonella overleven in de darm. Na de acute infectie, allen overlevenden nog steeds uitgevoerd Salmonella, die kunnen na infectie worden gedetecteerd zes maanden volgens de methode beschreven in dit voorstel. Zodra muizen 3 weken na besmetting overleven, muizen kreeg het lichaamsgewicht en minder overlijden (Fig.2). Bovendien, immunofluroscence vlekken gegevens tonen ook de invasie van Salmonella in intestinale mucosa 27 weken na de infectie (Fig.3). Deze gegevens toonden aan dat PhoP c, c PhoP Avra-of PhoP c AvrA-/AvrA + kan worden gebruikt voor de chronische infectie model.
Muizen met host resistentie factor Nramp1 + / + resistent zijn voor Salmonella besmetting 3-6. C57/BL6 muizen met Nramp gebreken vertoonden gebruik in de huidige studies. We vonden dat 90% muizen geïnfecteerd met pathogene Salmonella stam 14028s niet kan overleven meer dan 4 weken (gegevens niet getoond). Om te begrijpen op de lange termijn effecten van wild-type S. Typhimurium infectie, muizen met Nampr1 + / + kan worden gebruikt.
Dit model is gevestigd in een BSL-2 laboratorium. Ons protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Rochester University Comite voor de Resources (UCAR). Muizen die besmet zijn met Salmonella waarschijnlijk ongemak en verdriet te lijden en minder actief worden en langzaam bewegen. Hun vacht kunnen worden gegolfde en ze kunnen geen eten of drinken als normaal. De dieren zal nauw worden nageleefd en als een teken van ongemak, zoals niet in staat om goed genoeg om te wandelen hydratatie en calorie-inname te behouden Als een muis gaf een indicatie dat hij had vocht-of aanzienlijke hoeveelheid gewichtsverlies (10% of meer) 7 opgezogen, en deed niet meteen sterven, was de muis humaan laten inslapen. Alle laboratorium-personeel zal worden getraind inhet observeren van de muizen de juiste acht, negen.
Vele studies gebruikte de streptomycine-voorbehandeling gebruik hebben gemaakt van de colitis veroorzaakt door Salmonella typhimurium voor de studies op in de vroege fase van de infectie 1,2,10. Echter, slechts weinig rapport over de chronische infectie in muismodel in vivo 11. Muizen met Salmonella hardnekkige bestaan in het maagdarmkanaal kunnen we op de lange termijn gastheer-bacteriële interactie, signaaltransductie, en tumorigenese te verkennen. We hebben een chronische bacteriële infectie muismodel met Salmonella typhimurium kolonisatie in de darm muis meer dan 6 maanden. Dit model kan ook gebruikt worden voor E.coli pathogenese en probiotica studies. In het algemeen zal dit protocol hulp onderzoekers met de muis model van fundamenteel belang biologische en microbiologische vragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIDDK KO1 DK075386 te verlenen en de American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC tot Jun zon
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
