Summary
Biz küçük bir molekül tabanlı oligodendrosit öncü hücreler (OPC) içine fare embriyonik kök hücreleri farklılaşma için protokol açıklar. Bu protokol, 30 gün farklılaşma, yüksek verimlilik ile Olig2 + NG2 + OPC üretir. Ayrıca, aksiyon potansiyelleri ateş "spike" OPC oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Oligodendrosit, merkezi sinir sistemi myelinating hücreleri vardır. Demiyelinizan hastalıkları rejeneratif hücre tedavisi için, saf bir nüfus nakli için soy taahhüt oligodendrosit öncü hücreler (OPC) kaynaklanan önemli bir ilgi var. OPC, transkripsiyon faktörü Olig2 ve proteoglikan NG2 yüzey ifade aktivitesi ile karakterize edilir. GFP-Olig2 (G-Olig2) fare embriyonik kök hücre (Mesc) muhabiri hattı kullanarak, GFP + Olig2 + NG2 + OPC içine mESCs farklılaşması için koşulları optimize edilmiş. Bizim protokolde, ilk mESCs embriyoid organlarının nesil (EBS) açıklar. İkincisi, küçük moleküller Mesc türetilen EBS tedavi açıklar: (1) retinoik asit (RA) ve (2) belirlenen kültür koşulları altında sonik kirpi (Shh) agonist purmorphamine (Pur) oligodendroglial soy içine doğrudan EB farklılaşma. Bu yaklaşım, OPC 30 gün bir süre yüksek verim (>% 80) ile elde edilebilir. Bu protokolde mESCs türetilen hücreler primer doku kültürü ile elde edilen OPC fenotipik benzer. Mesc türetilen OPC in situ beyin OPC bir ICSI'nin açıklanan spike özelliği görünmüyor. Bu elektrofizyolojik özellik çalışma için, ektopik Na ifade ederek Mesc-türetilen OPC spike nesil tarif
Protocol
GFP-Olig2 fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) oligodendrosit öncü hücreler (OPC) üreten detaylı prosedürler:
- Fare ES hücre hattı GFP-Olig2 (G-Olig2), American Type Culture Collection (ATCC) satın alınmaktadır. MESCs ışınlanmış bir fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabaka üzerine 3 gün rutin olarak her geçişli. MEF hücreleri jelatin kaplı altı kuyu doku kültürü plaka EKH Pasajlanması önce en az bir gün% 0.1 kaplanmıştır. Mesc kültür orta,% 20 fetal sığır serumu (Gibco), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0,1 mM β-merkaptoetanol /,% 1 gerekli olmayan amino asitler (ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle Kullanıcı orta (DMEM) (Gibco) NEAA) ve 1000 U / ml lösemi inhibitör faktör.
- MES koloniler tek hücre içine tripsinize (TrypLE, 5 dk, 37 ° C) ve nakavt serum replasmanı (KSR) orta askıya alınır, daha sonra hücrelerin bir hücre Costar ultra-düşük ek altı plaka (Corning) aktarılır 50.000 hücre / cm 2 yoğunluğu. Bu koşullarda, mESCs embriyoid organları (EBS) oluşturur. KSR orta,% 20 KSR, 1 mM sodyum piruvat,% 1 NEAA, 0.1 mM β-mercaptoethanol / ile desteklenmiş-minimal temel orta (MEM) oluşur.
- Günden itibaren 7 gün 4, retinoik asit (RA, 0.2 M) ve purmorphamine (Pur, 1 M) Şekil dahildir. KSR veya N2 orta 1A. N2 orta 1X N2 takviyesi, 1 mM sodyum piruvat,% 1 NEAA ve 0.1 mM β-mercaptoethanol / içeren-MEM. Orta günlük değiştirildi.
- 8 gün, EBS, N2, orta ve fibroblast oluşur OPC orta% 0.01 polyornithine kaplı yemekleri TrypLE (5 dk, 37 ° C) kaplanmıştır kullanarak ayrıştırılmıştır büyüme faktörü-2 (FGF-2, 20 ng / ml). Orta olmak üzere iki günde bir değiştirilir.
- Hücreleri tripsinize (TrypLE, 3 dk, 37 ° C) ve konfluent olunca her hafta yaklaşık replated. 30 gün, hücrelerin% 80 GFP/Olig2 ifade, NG2 pozitif OPC, karakteristik.
- Spike OPC oluşturmak için BacMam Na + kanallı kit bu Mesc türetilen OPC Na v 1.2 altbirim tanıtmak amacıyla kullanılmıştır. BacMam reaktif (1 ml, komponent A), 5 ml nihai hacmi PBS ile karıştırılır. Daha sonra, karma BacMam reaktif önce PBS ile çalkalayın (% 50-70 izdiham) 60 mm kültür çanak Mesc türetilmiş bir OPC kültürü içine eklenir. 2 saat inkübasyondan sonra, karma BacMam reaktif 1X arttırıcı ile desteklenmiş OPC orta ile kaldırılır ve değiştirilir. Arttırıcı bileşeni B DMSO (component C) sulandırılmış. Sonra, ilave 2 saat inkübasyon sonra tam OPC orta arttırıcı ile orta kaldırılır ve değiştirilir. Hücrelerin 24 saat sonra test.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil farklılaşma protokolü takiben. 1A, G-Olig2 mESCs başlangıçta embriyoid organları (EBS) (Şekil 1B) oluşturmak için KSR orta ve 4 gün süreyle askıya alındı. Sonra, sırayla EBS RA ve Pur ile tedavi. EBS 4. Gün herhangi bir GFP floresan ve D8 (Şekil 1B) güçlü GFP floresan ifade vermedi. Bu noktada, EBS tripsinize ve büyüme faktörleri FGF-2 ile desteklenmiş N2 orta kaplanmış. 22 gün (D30) için daha fazla kültür sonra, GFP + hücre yüzdesi 80.3 ulaştı ± flow sitometri sonuçlarına göre% 0.6. Şekil. 1C, GFP + hücreler sürekli NG2 boyama (% 96.4 ± 1.3 GFP pozitif hücreler pozitif NG2 ve% 94.8 ± 1.5 NG2 pozitif hücreler, GFP pozitif idi) ile çakışıyordu. Böylece, bu hücreler OPC olarak tanımlayarak, GFP/Olig2 ve NG2 ifade.
Mesc türetilen OPC (76 hücreleri) depolarizasyon (Şekil 2A) üzerine aksiyon potansiyelleri yangın başarısız oldu. Bakülovirüs Na v 1.2 altbirim taşıyan bir uyum sonra, bu Mesc türetilen OPC (17 hücrelerinin% 94.1, 16) spike (Şekil 2B) olarak sınıflandırılabilir.
Şekil 1. Embriyoid vücut protokol gösteren OPC içine GOlig-Mesc Farklılaşma (A) Programı (EB) tabanlı ve küçük molekül odaklı farklılaşma. D8, EBS ayrıştırılmış ve kaplanmıştır. Konfluent oldu hücreleri haftada bir pasajlandı. (B) D8, ama D4 EBS, GFP ifade gösterdi. (C) NG2 (kırmızı) immün D30 GFP (yeşil) ifadesi ile uyumlu idi. DAPI (mavi), çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. Ölçek çubuğu: 20 mm.
Şekil 2. Mesc türetilen OPC nonspiking, OPC spike nesil virüs aracılı hücre 0 depolarize bile Na v kanal ifade (A) membran potansiyeli -60 mV ve Mesc türevi OPC yapıldı, aksiyon potansiyelleri yangın başarısız mV. (B) Mesc türetilen OPC bir örnekviral transdüksiyon sonra ateş aksiyon potansiyeli (kırmızı vurgulanmıştır).
Discussion
Oligodendrosit şartname de dahil olmak üzere, erken memeli geliştirme eğitimi için bir in vitro model sistemi sağlayarak, blastokist embriyo izole Embriyonik kök hücreler (EKH), 3, 4, organizmanın tüm hücre soyları ayırt edebilirsiniz. mESCs sonik kirpi (Shh) 5 tedavisinde oligodendrosit öncü hücreler (OPC) ayırt etmek için gösterilmiştir. Ayrıca, mESCs Shh kaynaklı OPC farklılaşma, embriyonik gelişim 6 gözlenen doğru zamanlama korur . Bu nedenle, in vitro OPC farklılaşmasında mESCs doğası in vivo geliştirme öğrendim ne ile tutarlı olarak kabul edilir. Burada, küçük moleküller RA ve Shh agonist Pur kullanarak, yüksek verimlilik ile GFP + Olig2 + NG2 + OPC başarıyla G-Olig2 mESCs farklılaşmış.
Toplam hücrelerinin önemli bir yüzdesini oluşturan (~% 5) ve proteoglikan NG2 7 ifadesi ve helix-loop-helix transkripsiyon faktörü Olig2 8 ile karakterize OPC, gelişmekte olan ve olgun MSS oligodendrosit oluşturmak ana prolifere hücre tipi 9. V kanal Na göstermiştir yaklaşık iki yıl araştırmacılar için bir OPC ICSI'nin ifade depolarizasyon 10, 11 üzerine devreye sokulabilir. Ayrıca, son çarpıcı bir gözlem 9 beyaz cevher in situ sıçan MSS, voltaj kapılı sodyum (Na V) kanalları, ifade bağlı olarak zaman depolarize, OPC (~% 50) aksiyon potansiyelleri oluşturulur ve böylece spike bölünmüştür olabilir alt popülasyonlar nonspiking. Ancak, bu spiking özellikleri fonksiyonları halen büyük ölçüde bilinmiyor. Biz elektrofizyolojik, Shh bağımlı protokol ile farklılaşmış Mesc kaynaklı OPC, in situ beyin OPC olarak aynı değildi, o bulundu . Subunit Na V 1.2 tanıttıktan sonra, bu sessiz Mesc türetilen OPC spike kabil edildi.
Böylece, spike / Mesc türetilen OPC ve farklılaşma protokol burada açıklanan nonspiking (1) spike ve nonspiking OPC arasındaki işlevsel farklılıklar, (2) Mesc kaynaklı OPC, sodyum kanal ifade teşvik tarama yeni faktörler eğitimi kolaylaştırmak ( 3) geliştirilmesi ve insan ESC veya uyarılan pluripotent kök hücreleri (iPSCs) OPC farklılaşma protokolü optimize.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü (RO1 NS059043 ve RO1 ES015988), Ulusal Multipl Skleroz Derneği, Anemi Araştırma, Feldstein Tıp Vakfı Roche Vakfı ve Çocuk Shriners Hastaneler WD hibe tarafından desteklenmiştir.
Biz Dr David Pleasure ve Jennifer Düzlem önerileriniz için teşekkür etmek istiyorum. Biz bu makalede ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
References
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
